[發明專利]鼠李糖脂生產質粒及其構建方法與大腸桿菌工程菌和應用

有效

• 申請號: 201611002289.6
• 申請日: 2016-11-14
• 公開（公告）號: CN106755031B
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 杜瑾;張愛君;姜天翔;郝建安;王靜
• 申請（專利權）人: 自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12P19/44;C12R1/19
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

1.一種鼠李糖脂生產質粒，其特征在于：為質粒DJ202，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.權利要求1所述鼠李糖脂生產質粒DJ202的構建方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)人工合成經密碼子優化的鼠李糖基轉移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；將SyrhlA通過酶切連接方式插入大腸桿菌表達質粒pET21a(+)的T7啟動子下游，得到質粒DJ201；

(2)密碼子優化鼠李糖基轉移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游設計大腸桿菌核糖體結合位點RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，構成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；

(3)將片段RBS-SyrhlB通過酶切連接方式插入質粒DJ201中SyrhlA下游，構成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，獲得質粒DJ202。

3.由權利要求1所述鼠李糖脂生產質粒DJ202獲得的大腸桿菌工程菌，其特征在于：是由上述質粒DJ202導入到大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得用于合成鼠李糖脂的大腸桿菌基因工程菌株BL202。

4.一種鼠李糖脂生產質粒，其特征在于：為質粒DJ208，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.權利要求4所述鼠李糖脂生產質粒DJ208的構建方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)人工合成經密碼子優化的鼠李糖基轉移酶基因SyrhlA，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；將SyrhlA通過酶切連接方式插入大腸桿菌表達質粒pET21a(+)的T7啟動子下游，得到質粒DJ201；

(2)密碼子優化鼠李糖基轉移酶基因SyrhlB，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；在SyrhlB上游設計大腸桿菌核糖體結合位點RBS，其基因序列如SEQ ID NO.5所示，構成片段RBS-SyrhlB，并人工合成；

(3)將片段RBS-SyrhlB通過酶切連接方式插入質粒DJ201中SyrhlA下游，構成片段SyrhlA-RBS-SyrhlB，獲得質粒DJ202；

(4)人工合成經密碼子優化的鼠李糖基轉移酶基因SyrhlC，其基因序列如SEQ ID NO.6所示；將SyrhlC通過酶切連接方式插入雙啟動子質粒pACYCDuet-1第二個T7啟動子下游，獲得質粒DJ205；

(5)將片段SyrhlA-RBS-SyrhlB通過PCR和酶切連接方式插入質粒DJ205中第一個T7啟動子下游，獲得質粒DJ208。

6.由權利要求4所述鼠李糖脂生產質粒DJ208獲得的大腸桿菌工程菌，其特征在于：是由上述質粒DJ208導入到大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得用于合成鼠李糖脂的大腸桿菌基因工程菌株BL208。