[發明專利]利用三維重組成像技術分析擬南芥根尖細胞結構的方法

有效

• 申請號: 201610993360.5
• 申請日: 2016-11-11
• 公開（公告）號: CN106568758B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 郝瑩;何大澄;肖雪媛
• 申請（專利權）人: 西北師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 蘭州智和專利代理事務所(普通合伙) 62201
• 代理人: 張英荷

本發明公開了一種利用三維重組成像技術分析擬南芥根尖細胞結構的方法，屬于細胞結構分析領域。本發明通過對擬南芥根進行橫向冰凍切片后，得到僅含有根冠部位的根部橫切，10μm的切片厚度大大降低了顯微鏡Z軸分辨率對成像真實性的影響；通過優化顯微拍攝的條件，減小拍攝步進至小于0.4μm，降低Pinhole值以確保計算的光學切片厚度小于0.8μm，保證了畫面的細膩程度，掃描范圍包含了一個中柱細胞從上至下的全部結構；可以得到更為細致的顯微鏡成像圖片，有效減少了非焦平面雜散光對圖像的影響，提高了圖像的分辨率，保證了研究對象結構真實性的呈現；利用這種三維圖像重組技術，能夠更加直觀、準確的確定細胞內部內質網結構。

技術領域

本發明涉及一種植物單細胞光學顯微整體成像方法，尤其涉及一種植物單細胞三維整體成像方法，屬于細胞結構分析領域。

背景技術

擬南芥（Arabidopsis thaliana）又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草。屬被子植物門，雙子葉植物綱，十字花科植物，其基因組大約為12500萬堿基對和5對染色體，是目前已知植物基因組中最小的。擬南芥是自花受粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。由于有上述這些優點，所以擬南芥是進行遺傳學研究的好材料，被科學家譽為“植物中的果蠅”，是一種應用廣泛的模式生物，全世界有超過六千家實驗室正在對擬南芥的生長發育及其對環境應答的過程開展深入研究。

目前對于擬南芥根尖細胞結構的分析，主要有毛細管電泳、微流控芯片、多種光學顯微鏡（熒光顯微鏡、聚焦熒光顯微鏡、全內反射熒光顯微鏡、多光子熒光顯微鏡、熒光相關顯微鏡、近場掃描光學顯微鏡等）、掃描電化學顯微鏡、質譜成像、原子力顯微鏡、掃描隧道顯微鏡圖像分析、阿達瑪變換顯微光譜及成像、腫瘤電化學及免疫分析、動力學分析、熒光及發光探針、納米技術以及實時動態檢測等。其中熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。然而，由于擬南芥幼苗的根尖非常細小，一般的根尖細胞顯微成像只能直接拿實物在光學顯微鏡下觀察，而且是根的縱向光學切片觀察，得到的結果不準確（因為有相鄰細胞遮擋的問題）。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種利用三維重組成像技術分析擬南芥根尖細胞結構的方法，以提高圖像的分辨率，保證研究對象結構真實性的呈現。

本發明利用三維重組成像技術分析擬南芥根尖細胞結構的方法，包括以下工藝步驟：

（1）擬南芥根尖的固定：將新鮮擬南芥籽苗迅速放入事先配好的4%多聚甲醛溶液中，室溫孵育30min；而后轉移至預冷的10%甘油中，放至干燥器中，真空抽氣30min；之后放入4℃保存。

（2）擬南芥根尖的冰凍切片：在預先速凍好的樣品托上涂一塊較厚（2~3cm）的OCT包埋膠，待膠凍住后用刀片修出一個方形臺；將之前固定的根尖依次同向擺放在臺子上，迅速用另一層包埋膠蓋住根尖；待包埋膠凍住后，再用刀片修塊，整體鏟下包埋有樣品的膠塊，確定根尖向外；最后將根尖向外的膠塊粘在樣品托上以0.3μm的步距切片。

（3）顯微鏡成像：先使用正置熒光顯微鏡ImagerA1在低倍鏡下挑選出目的切片，再使用共聚焦激光顯微鏡 LSM 510進行拍照。物鏡為：Plan-Neofluar×20/0.5、Plan-Neofluar×63/1.4和oilPlan-Neofluar×100/1.4 oil。濾光片設置為：檢測DAPI時，激發光405nm，發射光420nm-470nm；檢測FITC時，激發光488nm，發射光505nm-555nm。光學切片厚度0.3μm，掃描均值為2，圖片以1024×1024格式保存。使用Carl Zeiss AIM軟件和OlympusFluoview Ver.1.6軟件進行圖像的拍攝和分析。

（4）Image J圖像處理