[發明專利]一種等溫解開雙鏈DNA及制備單鏈DNA的方法

有效

• 申請號: 201610987745.0
• 申請日: 2016-11-10
• 公開（公告）號: CN106701738B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 唐卓;陳剛毅
• 申請（專利權）人: 中國科學院成都生物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于分子生物學技術領域，提供一種等溫解開雙鏈DNA的方法以及基于該方法制備單鏈DNA的方法。等溫解開雙鏈DNA的技術方案為利用重組酶結合單鏈DNA探針形成復合物，復合物識別雙鏈DNA中與單鏈DNA探針同源的序列并侵入雙鏈DNA，從而實現雙鏈DNA的等溫開鏈，隨后單鏈DNA探針和雙鏈中一條鏈互補配對，而單鏈結合蛋白結合另一條鏈穩定開鏈結構。基于該方案及單鏈DNA探針3’?末端可以被連接酶和聚合酶等酶識別的特性，本發明還提出了制備單鏈DNA的方案，并詳細介紹了通過連接酶或延伸酶制備單鏈DNA的方案。以上技術方案均可在等溫條件下完成，且無需ATP循環系統，甚至ATP可被dATP替代，所用酶來源廣泛、易于獲得，為等溫技術以雙鏈DNA作為研究對象提供了一個通用平臺。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及雙鏈DNA的解鏈和單鏈DNA的制備，具體涉及一種普適的利用重組酶和單鏈DNA等溫解開雙鏈DNA的方法及用其制備單鏈DNA的方法。

背景技術

DNA是基因的載體，其攜帶的遺傳信息編碼了細胞內所有結構蛋白質和功能蛋白質的氨基酸序列。除少部分病毒外生物體內基因組幾乎都以雙鏈形式存在。然而，體外以DNA為基礎的諸多基本操作如DNA雜交、連接、擴增等均利用的是探針或引物與目標DNA序列之間堿基互補配對的原理。因此，將雙鏈DNA解開是所有DNA基本操作的前提以及后續如基因檢測、測序、編輯等一系列應用的關鍵。常用解開雙鏈的方法分為物理法和化學法。物理法主要是通過加熱使兩條單鏈分離的熱變性法。而化學法主要是利用變性劑如尿素、強堿等破壞兩條單鏈之間形成的氫鍵。這兩種方法雖然使雙鏈打開徹底，但是前者受到加熱裝置限制，不僅增加成本且降低了便攜性，后者則因為反應條件太過劇烈且成分復雜而不適于酶促反應等諸多生化反應。因此，建立一種等溫、便捷、經濟且生物兼容性強的雙鏈DNA解開方法具有重要的科學意義和實用價值。

由于大多數工作僅需針對基因組DNA中的部分序列進行研究，因此，對目標序列的提取當屬首要任務。常用的技術為PCR擴增，但該技術需要熱變性及反復的熱循環，儀器依賴性高且操作復雜。隨著目前對儀器設備便攜性、經濟性和快捷性的要求越來越高，人們更青睞于基于等溫反應的技術和設備。然而大多數等溫反應僅能以單鏈DNA為直接的研究對象，如極具代表性的等溫基因檢測技術——依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)、鏈置換擴增技術(SDA)、滾換復制技術(LRCA和HRCA)、環介導核酸等溫擴增技術(LAMP)等。目前用于獲得單鏈的方法主要有：(1)利用熱變性、內外引物及鏈置換相結合的策略。雙鏈DNA熱變性開鏈，引物與模板雜交后，外引物延伸過程中將內引物的延伸產物置換出來獲得單鏈；(2)通過不對稱PCR使雙鏈產物的其中一條鏈線性積累；(3)通過內切酶將長的基因組模板切割成短的核酸片段，利用Lambda、ExoIII等外切酶降解雙鏈中的其中一條鏈最終獲得目的單鏈。其中方法(1)和(2)均無法擺脫熱變性和加熱設備，違背了等溫反應的初衷；方法(3)雖然能避免對儀器的依賴，但是內切酶需要識別特異的序列，大大降低了其通用性。因此，亟需設計一種能夠在等溫條件下以雙鏈DNA為模板制備單鏈DNA的通用方案，以配合快速發展的等溫技術，建立系統完善的適用于廣泛DNA樣本的等溫操作體系。

發明內容

本發明目的在于提供一種等溫條件下解開雙鏈DNA的方法以及利用此方法在不依賴昂貴儀器的情況下迅速、簡便地制備單鏈DNA的方法，為等溫反應技術能直接以雙鏈DNA為研究對象提供一種通用的解決方案。

實現以上目的的技術方案如下：

一種等溫解開雙鏈DNA的方法，其技術方案為：針對雙鏈DNA中的目的序列的一條鏈設計一段互補的單鏈DNA探針。在高濃度ATP或dATP存在的情況下，重組酶首先與單鏈DNA探針形成復合物，然后向體系中加入雙鏈DNA和單鏈結合蛋白SSB；復合物掃描雙鏈DNA，當遇到與單鏈DNA探針同源的區域時，雙鏈DNA被解開，單鏈DNA探針與其互補鏈配對形成異源雙鏈，另一條鏈與單鏈結合蛋白SSB結合形成穩定的開鏈結構。