[發明專利]以甘藍型油菜下胚軸為外植體獲得懸浮細胞系的方法及其應用

在審

• 申請號: 201610986021.4
• 申請日: 2016-11-09
• 公開（公告）號: CN108064687A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 徐芳森;周婷;華營鵬;丁廣大;石磊
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

本發明屬于植物細胞培養技術領域。具體涉及以甘藍型油菜下胚軸為外植體獲得懸浮細胞系的方法及其應用。本發明以甘藍型油菜無菌下胚軸為外植體，通過胚性愈傷組織的誘導，懸浮細胞的培養等步驟建立了甘藍型油菜懸浮細胞系，并利用該體系研究比較了必需微量營養元素正常和缺乏條件下懸浮細胞的形態和活性差異。本發明所制備的甘藍型油菜懸浮細胞活性高，形態穩定均一，培養周期短，不受季節、氣候等自然環境因素的限制，可用于甘藍型油菜單細胞水平上細胞發育、以及在非生物脅迫下細胞生長、形態形貌、養分跨膜轉運、生理生化代謝和基因表達等方面的研究與應用。

技術領域

本發明屬于植物細胞培養技術領域，具體涉及以甘藍型油菜下胚軸為外植體獲得懸浮細胞系的方法及其應用。

背景技術

甘藍型油菜(Brassica napus L.)，十字花科，是世界上最重要的油料作物之一，在我國已成為繼水稻、玉米、小麥、大豆之后的第五大作物，也是第一大油料作物，常年種植面積約670萬hm 2，廣泛分布于我國長江流域，總產超過1 100萬t，年產菜籽油約450萬t，占自產植物油總量的40％以上，占草本植物油總量的57％以上。傳統上對甘藍型油菜的研究都是基于植株，然而植株本身的復雜性導致研究進展緩慢，懸浮細胞作為單細胞避免了植株整體的復雜性。近年來，單細胞研究在其他物種上得到廣泛應用，然而甘藍型油菜仍缺乏一種高效，簡便的單細胞培養技術。

懸浮細胞作為一種單細胞得到了廣泛關注，傳統的甘藍型油菜懸浮細胞培養體系獲得的方法是利用小孢子培養得到的(Orr W.,Keller W.A.and Singh J.1986,J.PlantPhysiol.126:23-32)，隨后利用小孢子培養的方法取得的懸浮細胞系在一定程度上促進了甘藍型油菜的研究(Carswell,M.C.,Grant,B.R.and Plaxton,W.C.,1997.Planta,203(1),pp.67-74；Moraes,T.F.and Plaxton,W.C.,2000.European Journal of Biochemistry,267(14),pp.4465-4476；Palma,D.A.,Blumwald,E.and Plaxton,W.C.,2000.FEBSletters,486(2),pp.155-158；Smith,C.R.,Knowles,V.L.and Plaxton,W.C.,2000.European Journal of Biochemistry,267(14),pp.4477-4485；Plaxton,W.C.,Smith,C.R.and Knowles,V.L.,2002.Archives of biochemistry and biophysics,400(1),pp.54-62；Singh,V.K.,Wood,S.M.,Knowles,V.L.and Plaxton,W.C.,2003.Planta,218(2),pp.233-239.)，但是利用小孢子培養的方法獲得的懸浮細胞系存在如下缺點：(1)易受取材季節制約，甘藍型油菜每年開花一次，不能隨時取樣培養；(2)花粉在培養前要進行鏡檢以確定適宜的花粉發育時期，操作不方便，且易錯過花粉發育的最好時期；(3)親本植株的生理狀態對愈傷組織誘導頻率有直接影響，在氣候環境不穩定的季節，油菜小孢子愈傷誘導率有明顯差異。這些缺點嚴重制約了甘藍型油菜單細胞水平的研究，因此，發明一種操作簡便、不受季節和環境因子限制的獲得甘藍型油菜懸浮細胞系的方法是必要的。

新興的甘藍型油菜懸浮細胞培養體系獲得的方法著手于利用室內組培苗的方法，嘗試利 用甘藍型油菜下胚軸為外植體獲得的懸浮細胞系(王火焰等，2002年，植物營養與肥料學報。8(1)：100～104；楊玉華等，2002年，湖北農學院學報.22(4)：289-292；楊露，2012年，華中農業大學碩士畢業論文；Hua,Y等，2016，Plant,cell&environment,39(7),p.1601.)，克服了上述小孢子培養操作不方便及易受季節和環境因子限制的缺點，但是從公開的文章來看，該方法建立的細胞系細胞分散程度差，嚴重畸形，活力極低，難以為甘藍型油菜的單細胞水平研究提供優異的生物材料。