[發(fā)明專(zhuān)利]制備L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610985353.0
• 申請(qǐng)日: 2016-11-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107058200B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃愛(ài)清;王永橋;宋長(zhǎng)紅;王金才;朱嘉震;王洪果;史峻嵩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東格得生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N9/10;C12P19/60;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 張貴賓

本發(fā)明涉及一種重組蔗糖磷酸化酶的工程菌株制備L?抗壞血酸?2?葡萄糖苷的方法。重組蔗糖磷酸化酶的工程菌株的保藏號(hào)為：CCTCC M 2016496，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編430072。本發(fā)明采用基因重組和定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建重組蔗糖磷酸化酶的工程菌株。以發(fā)酵所得菌體細(xì)胞為生物催化劑，在檸檬酸三鈉緩沖液體系中，以蔗糖和L?抗壞血酸為原料制備AA?2G。本發(fā)明直接采用蔗糖為糖基供體，原料易溶于水，而且價(jià)廉易得。同時(shí)產(chǎn)物單一，反應(yīng)產(chǎn)物主要為AA?2G，收率高達(dá)65%，不需額外添加糖化酶處理，生產(chǎn)成本低。

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物催化劑制備L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種制備L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的方法。

（二）背景技術(shù)

L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷,即2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗壞血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbid acid，AA-2G），是由日本林原生物化學(xué)研究所與岡山大學(xué)藥學(xué)系年共同發(fā)現(xiàn)的一種的L-抗壞血酸（即維生素C）的葡萄糖苷衍生物（J. Biochem. 107,222-227 (1990)；Agric. Biol. Chem., 54 (7),1697-1703（1990）；US5084563（1992））。它具有抗壞血酸的生理活性，同時(shí)由于L-抗壞血酸的2位C上的羥基以α-1，4糖苷鍵與葡萄糖相連接形成穩(wěn)定的穩(wěn)定的糖苷鍵，顯著降低L-抗壞血酸的還原性，穩(wěn)定性大大提高。目前，AA-2G主要應(yīng)用于化妝品行業(yè)，具有抗UV、抑制黑色素等美白功效作用。

日本學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)AA-2G時(shí)，是采用來(lái)源于根霉屬或毛霉屬的a-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，α-Glucosidase）作為催化劑劑，但是AA-2G產(chǎn)物濃度極低，后來(lái)發(fā)現(xiàn)使用源自嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）的環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（EC2.4.1.19，Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)CGTase）作為催化劑，以環(huán)糊精和L-抗壞血酸為原料制備AA-2G，轉(zhuǎn)化率提高至45%（Agric. Biol. Chem., 55 (7), 1751-1756, 1991）。后來(lái)陸續(xù)報(bào)道一些其他糖基轉(zhuǎn)移酶也能以相應(yīng)糖基供體（如麥芽糖、低聚糊精、淀粉等）和L-抗壞血酸及鈉鹽為原料來(lái)生物催化合成AA-2G。所以，目前所報(bào)道的AA-2G生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20，α-Glucosidase）（US3763009（1973））、環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（EC 2.4.1.19，Cyclomaltodextrin Glucanotransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)CGTase）（US5084563（1992）、US5137723（1992）、和US5407812（1995）、US9265781B2（2016））、α-淀粉酶（EC 3.2.1.1，α-Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC 2.4.1.7，Sucrose phosphorylas）（Biotechnol Lett 29:611–615，2007）、葡聚糖蔗糖酶（EC 2.4.1.5，Dextransucrase）（Microbiological Research 165：384-391，2010）、α-異麥芽糖基葡糖基糖形成酶（US20060216792（2006）、US8759030（2014）和CN201510179664（2015））等6類(lèi)酶。

目前AA-2G工業(yè)化生產(chǎn)上采用CGTase為生物催化劑，但是采用路線(xiàn)還存在以下不足之處：

一是生產(chǎn)所用的CGTase酶為商業(yè)化酶制劑，而不是采用最為直接的CGTase發(fā)酵液或者含CGTase酶 的菌體細(xì)胞，究其原因是目前CGTase發(fā)酵酶活力普遍不高，酶活力低無(wú)法滿(mǎn)足制備AA-2G的酶活要求；另外，若采用CGTase發(fā)酵液或菌體為催化劑，則需要經(jīng)菌體破碎、濃縮等操作步驟達(dá)到制備AA-2G的酶活要求。

二是除生成目標(biāo)產(chǎn)物AA-2G外，還會(huì)生成一系列的二糖、三糖、四糖以及五糖等多糖基衍生物，還需額外添加a-糖化酶進(jìn)行水解多糖基衍生物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物AA-2G，增加工藝步驟。