[發(fā)明專利]可檢測與區(qū)分羊巴貝斯蟲未定種新疆株的引物對與試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610976076.7
• 申請日: 2015-01-24
• 公開（公告）號: CN106636347A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉愛紅;劉軍龍;關(guān)貴全;謝俊仁;羅建勛;殷宏
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11;C12R1/90
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司62102
• 代理人: 張晉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于快速檢測與區(qū)分動物血液原蟲病的試劑盒。確切講本發(fā)明涉及一種不僅能用于檢測，而且能準(zhǔn)確區(qū)分我國分布的兩種感染羊的巴貝斯蟲，即莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種新疆株的引物對及檢測試劑盒。

背景技術(shù)

羊的巴貝斯蟲病是一種經(jīng)蜱傳播的血液原蟲病，由綿羊巴貝斯蟲、莫氏巴貝斯、粗糙巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種等引起，使感染動物出現(xiàn)發(fā)熱、黃疸、貧血、血紅蛋白尿、甚至死亡。該病在熱帶、亞熱帶、溫帶均有流行，給世界畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害。其中綿羊巴貝斯蟲(Babesia. ovis)與莫氏巴貝斯蟲(B. motasi)是引起羊巴貝斯蟲病的主要病原；綿羊巴貝斯蟲蟲體小，對小反芻動物致病力高，傳播媒介是囊形扇頭蜱(Uilenberg et al., 1980)。莫氏巴貝斯蟲蟲體較大，刻點(diǎn)血蜱為其傳播媒介(Alani and Herbert, 1988; Uilenberg et al.,1980)。粗糙巴貝斯蟲(B. crass)是一種大型的非致病性的巴貝斯蟲，與莫氏巴貝斯蟲和綿羊巴貝斯蟲在形態(tài)、血清學(xué)、分子進(jìn)化方面有很大差異(Hashemi-Fesharki and Uilenberg, 1981; Schnittger et al., 2003)。

在我國，羊的巴貝斯蟲病最早在1982 年 和1986年由陳德明和趙錫榮等分別在四川和黑龍江省發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，當(dāng)時并未引起獸醫(yī)防治部門的重視。自1997年以來，筆者所在實(shí)驗(yàn)室，即中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲與蟲媒病團(tuán)隊(duì)先后對我國部分省區(qū)羊的巴貝斯蟲病進(jìn)行了選點(diǎn)調(diào)查，采用血液接種和蜱傳播試驗(yàn)的方法先后自遼寧、 河北、 甘肅和新疆等省份分離獲得了羊的巴貝斯蟲不同地方株，并發(fā)現(xiàn)這些地區(qū)該病流行比較嚴(yán)重，病原對外地引進(jìn)良種羊致病性較強(qiáng)，嚴(yán)重制約了羊的品種改良。依據(jù)真核生物核糖體 18S rRNA 和 ITS 基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合適的引物，對這些地方分離株進(jìn)行測序分析，序列比對結(jié)果顯示：這些感染羊的巴貝斯蟲可分為兩組；一組為莫氏巴貝斯蟲（包括莫氏巴貝斯蟲臨潭株、莫氏巴貝斯蟲寧縣株、莫氏巴貝斯蟲天祝株、莫氏巴貝斯蟲麻當(dāng)株和莫氏巴貝斯蟲河北株），另一組為羊巴貝斯蟲未定種新疆株(Guan et al., 2009; Liu et al., 2007b; Niu et al., 2009a)。另外，經(jīng)傳播實(shí)驗(yàn)證實(shí)，莫氏巴貝斯蟲寧縣株和臨潭株的傳播媒介為青海血蜱和長角血蜱(Bai et al., 2002; Guan et al., 2010c)；羊巴貝斯蟲未定種新疆株的傳播媒介為小亞璃眼蜱。這三種蜱在我國廣范分布(Chen et al.,2010; Yin and Luo,2007; 陳澤等,2008; 鄧國藩, 1960)；同時，還建立了各種分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測技術(shù)，通過流行病學(xué)調(diào)查顯示，在中國，羊巴貝斯蟲病的感染率為１１．２％～３１．７％，在甘肅甘南牧區(qū)高達(dá)８２．３８％（Guan et al, 2012）。且我國分離的感染羊的巴貝斯蟲，即莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種新疆株在流行區(qū)內(nèi)常呈混合感染或隱性感染狀態(tài)，不同病原之間的鑒別診斷一直是困擾該病流行病學(xué)調(diào)查的技術(shù)瓶頸。

目前常用的診斷該病的方法為血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期時很難在顯微鏡下檢查出病原，而且操作熟練程度將直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。還有很多血清學(xué)方法，但都存在一定的假陽性或假陰性以及交叉反應(yīng)。分子生物學(xué)診斷方法有套式PCR檢測方法, LAMP檢測方法(Guan et al., 2010e；Guan et al, 2012)，但套式PCR檢測過程中容易造成環(huán)境污染，LAMP檢測過程中容易出現(xiàn)假陽性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，能快速、特異、靈敏的檢測綿羊、山羊和自然媒介蜱體內(nèi)羊巴貝斯蟲感染，而且能準(zhǔn)確區(qū)分我國分布的兩種感染羊的巴貝斯蟲，即莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種新疆株的引物對及試劑盒。

本發(fā)明的可用于檢測羊莫氏巴貝斯蟲的引物對基因序列為：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。本發(fā)明的可用于檢測羊巴貝斯蟲未定種新疆株的引物對基因序列為：SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。