[發(fā)明專利]變異葡萄糖脫氫酶及其使用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610973614.7
• 申請日: 2016-10-28
• 公開（公告）號: CN107058249B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 小島勝博;森一茂
• 申請（專利權(quán)）人: 愛科來株式會社;究極酵素國際股份有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12Q1/54;C12Q1/32
• 代理公司: 北京東方億思知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11258
• 代理人: 樸今春

本發(fā)明涉及變異葡萄糖脫氫酶及其使用。本發(fā)明提供一種變異葡萄糖脫氫酶，其包含變異葡萄糖脫氫酶α亞單位，所述變異葡萄糖脫氫酶α亞單位是在序列號3的氨基酸序列中，474位的天冬酰胺被甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸或半胱氨酸取代，并且，所述變異葡萄糖脫氫酶具有葡萄糖脫氫酶活性，對木糖的反應(yīng)性降低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及底物特異性提高的變異葡萄糖脫氫酶(GDH)。詳細(xì)地講，本發(fā)明涉及包含變異型α亞單位的GDH。本發(fā)明的GDH可以適當(dāng)?shù)赜糜谄咸烟莻鞲衅骷捌咸烟菣z測試劑盒等，在生物化學(xué)領(lǐng)域、臨床領(lǐng)域等中有用。

背景技術(shù)

目前，將野生型的含細(xì)胞色素C的GDH(CyGDH)及以吡咯并喹啉苯醌作為輔酶的PQQGDH用于血糖自測傳感器。然而，野生型的CyGDH及PQQGDH有以下缺點：由于其不僅與葡萄糖反應(yīng)而且還與麥芽糖反應(yīng)，因此不能測定準(zhǔn)確的血糖值。

專利文獻(xiàn)1中雖然公開了對二糖類的反應(yīng)性低、且在α亞單位的326位、365位以及472位具有變異的變異GDH，但顯示反應(yīng)性低的僅僅是針對麥芽糖，并沒有公開對木糖以及半乳糖的反應(yīng)性低的變異GDH。

在先技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2012-090563號公報。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明要解決的技術(shù)問題

本發(fā)明的課題在于，提供一種對木糖、優(yōu)選木糖以及半乳糖的反應(yīng)性低、且對葡萄糖的底物特異性提高的GDH。

用于解決技術(shù)問題的手段

本發(fā)明人為了解決如上所述的課題而進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在依次包含下面敘述的肽序列(i)～(v)的520～550個氨基酸的GDHα亞單位的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的組氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺中的一個以上，會降低對木糖以及半乳糖的反應(yīng)性，并提高對葡萄糖的底物特異性，而且，根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，成功地得到葡萄糖傳感器等中有用的變異GDH，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明為以下的內(nèi)容。

(1)一種變異GDH，其包含變異葡萄糖脫氫酶α亞單位，所述變異葡萄糖脫氫酶α亞單位具有在依次包含下面的肽序列(i)～(v)的520～550氨基酸的葡萄糖脫氫酶α亞單位的氨基酸序列中、以其他氨基酸取代肽序列(iii)的10位的甘氨酸、肽序列(iv)的4位的組氨酸、以及肽序列(v)的4位的天冬酰胺的一個以上的氨基酸序列，其中，所述變異葡萄糖脫氫酶具有葡萄糖脫氫酶活性，對木糖的反應(yīng)性降低。

(i)Val/Ile Val/Ile Val/Ile Gly Ser Gly Val Ala Gly(序列號21)

(ii)Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys(序列號22)

(iii)Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly Thr Gly(序列號23)

(iv)Lys Lys Ile/Leu His Leu SerAsn(序列號24)

(v)Phe Ala Pro/Asn Asn Asn His Ile(序列號25)

(2)根據(jù)(1)所述的變異GDH，其中，與從肽序列(ii)的8位的Met、肽序列(iii)的12位的Gly、肽序列(iv)的6位的Ser、肽序列(v)的2位的Ala、肽序列(v)的3位的Pro/Asn、肽序列(v)的5位的Asn以及肽序列(v)的7位的Ile中選擇的至少一個氨基酸殘基相當(dāng)?shù)陌被釟埢€被其他氨基酸殘基取代。