[發(fā)明專(zhuān)利]一種多誘導(dǎo)劑制備大鼠肝S9的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610972706.3
• 申請(qǐng)日: 2016-10-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108018257A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/071
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/071;C07K14/47;C12N9/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明提供一種多誘導(dǎo)劑制備大鼠肝S9的方法，包括步驟：(a)誘導(dǎo)劑以灌喂和腹腔注射的方式誘導(dǎo)大鼠；(b)斷頭處死大鼠，無(wú)菌條件下，清洗液沖洗肝中殘血，取出肝臟；(c)按一定的肝濕重比加入預(yù)冷的儲(chǔ)存緩沖液，充分剪碎，冰浴中勻漿；(d)將勻漿好的組織液低速離心，收集上清和沉淀，沉淀加入一定比重的儲(chǔ)存緩沖液重懸后再次低速離心取上清，合并上清經(jīng)冷凍高速離心后收集上清，即肝S9；(e)檢測(cè)依賴(lài)肝S9的誘變劑環(huán)磷酰胺對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的致畸變作用；本發(fā)明提供的大鼠肝S9制備方法顯著提高了肝S9的酶活性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白酶學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種多誘導(dǎo)劑制備大鼠肝S9的方法。

背景技術(shù)

大鼠肝細(xì)胞S9是大鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞勻漿液的去線粒體上清液，包含了大量的CYPs等藥物代謝酶，其在藥物體外代謝的研究中具有快速簡(jiǎn)便、靈敏、經(jīng)濟(jì)且可進(jìn)行高通量篩選的特點(diǎn)，因此常用作體外研究藥物代謝和藥物相互作用的工具。同時(shí)許多致癌劑的生物轉(zhuǎn)化是依靠細(xì)胞內(nèi)微粒體混合功能氧化酶系來(lái)完成的，所以大鼠肝S9是許多體外研究致癌劑生物轉(zhuǎn)化的活化系統(tǒng)。

傳統(tǒng)的大鼠肝S9誘導(dǎo)劑為多氯聯(lián)苯，但因其是致癌劑，嚴(yán)重污染環(huán)境，現(xiàn)許多國(guó)家已禁止生產(chǎn)。本發(fā)明通過(guò)多種誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)的方法制備大鼠肝S9，獲得具有高酶活性的大鼠肝S9。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一種可以獲得高產(chǎn)量的肝S9以及較高的P450酶含量的大鼠肝S9制備方法。

為了解決上述所涉及到的問(wèn)題，本發(fā)明采取如下方法制備大鼠肝S9：大鼠肝S9的誘導(dǎo)及制備方法的步驟包括：(a)誘導(dǎo)劑以灌喂和腹腔注射的方式誘導(dǎo)SD大鼠；(b)斷頭處死大鼠，無(wú)菌條件下，清洗液沖洗肝中殘血，取出肝臟；(c)按一定的肝濕重比加入預(yù)冷的儲(chǔ)存緩沖液，充分剪碎，冰浴中勻漿；(d)將勻漿好的組織液低速離心，收集上清和沉淀，沉淀加入一定比重的儲(chǔ)存液重懸后再次低速離心取上清，合并上清經(jīng)冷凍高速離心后收集上清，即肝S9；(e)檢測(cè)依賴(lài)肝S9的誘變劑環(huán)磷酰胺對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的致畸變作用；本發(fā)明提供的大鼠肝S9制備方法顯著提高了肝S9的酶活性。

可選的誘導(dǎo)劑為苯巴比妥鈉、β-奈黃酮和地塞米松。

可選的誘導(dǎo)方法為大鼠連續(xù)3d腹腔注射劑量為80mg/kg的苯巴比妥鈉，灌喂劑量為80mg/kg地塞米松和80mg/kg的β-萘黃酮，第4d注射劑量為40mg/kg的苯巴比妥鈉，灌喂劑量為40mg/kg地塞米松和40mg/kg的β-萘黃酮。

可選的除去肝中殘血的方法是將預(yù)冷的清洗液經(jīng)肝門(mén)靜脈灌洗除去殘血，清洗液為含1.15％KCl和20％肝素(1500U/mL)，pH為7.4的10mM PBS。

可選的肝濕重比的比例為1∶2-1∶4。

可選的儲(chǔ)存緩沖液為0.15M KCl(pH 7.4)。

可選的加入預(yù)冷的儲(chǔ)存緩沖液的量是沉淀重量的1-2倍。

本發(fā)明提供了一種多誘導(dǎo)劑聯(lián)合誘導(dǎo)制備大鼠肝S9的方法，大大提高了肝S9的酶活性。

附圖說(shuō)明

圖1：CA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠肝S9對(duì)染色體畸變的影響

圖2：環(huán)磷酰胺作用后的CHL細(xì)胞(a.正常、b.雙著絲粒、c.交聯(lián)、d.斷裂)

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)勢(shì)更清新地展現(xiàn)，現(xiàn)將具體實(shí)施方式進(jìn)一步闡述。此處所闡述的具體實(shí)施方式僅針對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋?zhuān)⒉挥糜谙薅ū景l(fā)明。

本發(fā)明選擇體重為230±20g的SD雄性大鼠制備肝S9。具體操作如下：