[發明專利]用于重編程細胞的包含純化的經修飾的RNA的RNA制劑

有效

• 申請號: 201610971165.2
• 申請日: 2010-12-07
• 公開（公告）號: CN107090436B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 凱塔林·卡里科;德魯·韋斯曼;加里·達爾;安東尼·珀森;朱迪思·邁斯;杰羅姆·詹德里薩克
• 申請（專利權）人: 賓夕法尼亞州大學信托人
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/117;C12N15/85;C12N15/87
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 黃登高;黃念

1.一種降低通過體外轉錄獲得的體外合成的RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體的制劑對哺乳動物細胞的免疫原性的非治療方法或體外方法，所述RNA分子包含替代尿苷(U)的選自假尿苷(Ψ)、1-甲基假尿苷(m¹Ψ)、5-甲基尿苷(m⁵U)、5-甲氧基尿苷(mo⁵U)和2-硫尿苷(s²U)的修飾核苷，

其中所述RNA分子具有包含至少120個核苷酸的長度，

所述方法包括：

純化所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體的制劑以除去通過誘導先天性免疫反應而對哺乳動物細胞具有毒性的污染物，所述污染物包括雙鏈RNA分子；

從而產生包含所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體的純化的RNA制劑，其與未進行所述純化的RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體的相同制劑相比，在所述哺乳動物細胞中顯示降低的免疫原性。

2.權利要求1所述的方法，其中所述體外合成的RNA分子的制劑在其中至少一部分UTP已被選自Ψ、m¹Ψ、m⁵U、mo⁵U和s²U的修飾核苷的相應三磷酸酯衍生物替代的反應中通過體外轉錄而獲得。

3.權利要求2所述的方法，其中所述體外合成的RNA分子的制劑進一步包含修飾核苷5-甲基胞苷(m⁵C)，并且在其中至少一部分CTP也已被m⁵C的相應三磷酸酯衍生物替代的反應中通過體外轉錄而獲得。

4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述通過誘導先天性免疫反應而對所述哺乳動物細胞具有毒性的污染物進一步包括未加帽的RNA分子。

5.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述純化的RNA制劑的所述降低的免疫原性通過測量將所述純化的RNA制劑引入所述細胞或使所述細胞與所述純化的RNA制劑接觸后缺乏炎性細胞因子的產生而檢測。

6.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述純化的RNA制劑的所述降低的免疫原性通過測量與引入或接觸未進行所述純化的相同量的所述RNA制劑的細胞相比，由引入或接觸所述純化的RNA制劑的細胞對選自IL-12、IFN-α、TNF-α、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、IL-6、IFN-β和IL-8的細胞因子的較少分泌而檢測。

7.權利要求中1-3中任一項所述的方法，其中所述經純化的RNA制劑：

(a) 不含一定量的RNA污染分子，所述RNA污染分子如果存在，在引入或接觸所述哺乳動物細胞后，將能夠激活足以阻止所述細胞存活的免疫反應；

(b) 可以重復給予而不引起足以可檢測地降低由所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體編碼的重組蛋白表達的免疫反應；

(c) 可以重復引入而不引起足以消除由所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體編碼的蛋白的可檢測表達的免疫反應；和/或

(d)可在不觸發可檢測的免疫反應的情況下給予。

8.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述純化的RNA制劑使用選自以下的至少一種方法產生：

a)一種過程，包括用特異性消化一種或多種污染RNA或污染DNA核酸的一種或多種酶處理所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體，使得產生所述純化的RNA制劑；

b)一種過程，包括使包含所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體的組合物經歷柱純化，使得產生所述純化的RNA制劑；和

c)一種過程，包括用核糖核酸酶III(RNA酶III)處理包含所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體的組合物，使得產生短的RNA酶III消化產物，然后從各所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治療載體純化掉所述短的RNA酶III消化產物和RNA酶III，使得產生所述純化的RNA制劑。