[發(fā)明專利]重組多肽的制造方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610970936.6
• 申請(qǐng)日: 2012-03-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106995831A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田淵久大;杉山朋也
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中外制藥株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C07K16/00;C12N15/113
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司11021
• 代理人: 柳春琦

本申請(qǐng)是2012年3月30日提交的同名發(fā)明專利申請(qǐng)201280015594.2的分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及重組多肽的制造方法，更具體而言，使用核因子κB抑制物α(NfkBia)的表達(dá)降低的動(dòng)物細(xì)胞有效制造多肽的方法。

【背景技術(shù)】

使用基因重組技術(shù)，生產(chǎn)作為醫(yī)藥有用的蛋白質(zhì)之時(shí)，使用動(dòng)物細(xì)胞，則由于原核細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行的復(fù)雜的翻譯后修飾或折疊變得可能，動(dòng)物細(xì)胞多用作用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。

近年、抗體或生理活性蛋白質(zhì)等的多種生物藥品輩出，在動(dòng)物細(xì)胞中有效生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的技術(shù)關(guān)系到生物藥品的低成本化，從而約束向患者的穩(wěn)定的供給。

從而，期望生產(chǎn)效率更高的蛋白質(zhì)的制造方法。

NfkBia(IKBα、核因子κB抑制物α)是B-細(xì)胞抑制物中κ多肽基因增強(qiáng)子的核因子，α的簡(jiǎn)稱，與作為涉及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞的轉(zhuǎn)錄因子的NF-κB的活化相關(guān)。NfkBia是NF-κB的失活因子之一。新生物合成的NfkBia通過(guò)在核內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性(非專利文獻(xiàn)1)。另外，如NfkBia一樣抑制細(xì)胞增殖的一部分的基因表達(dá)在幾乎全部的小鼠或人腫瘤細(xì)胞中被抑制(非專利文獻(xiàn)2)。NF-κB通常與如NfkBia一樣的失活因子結(jié)合著存在，但由各種刺激從失活因子游離活化，遷移到核內(nèi)，與在細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、粘接分子、細(xì)胞死亡控制因子其他各種各樣的目標(biāo)基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域的特異性DNA序列(5’-GGGACTTTCC-3’、稱為NFκB結(jié)合序列、kB基序、NFkB應(yīng)答元件等(SEQ ID NO:35))結(jié)合，與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)相關(guān)(非專利文獻(xiàn)3)。

另一方面，作為在動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的NfkBia的行為，不知與重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生能力的關(guān)系。

【現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)】

【非專利文獻(xiàn)】

非專利文獻(xiàn)1:Inducible nuclear expression of newly synthesized I kappa B alpha negatively regulates DNA-binding and transcriptional activities of NF-kappa BMol.Cell.Biol.,05 1995,2689-2696,Vol 15,No.5

非專利文獻(xiàn)2:From mice to humans:Identification of commonly deregulated genes in mammary cancer via comparative SAGE studies Hu Y.,Sun H.,Drake J.,Kittrell F.,Abba M.C.,Deng L.,Gaddis S.,Sahin A.,Baggerly K.,Medina D.and Aldaz C.M.Cancer Research2004 64:21(7748-7755)

非專利文獻(xiàn)3:"New insights into the Role of Nuclear Factor-kappa B in Cell Growth Regulation"American Journal of Pathology,2001,Vol.159,No.2:387-397

【發(fā)明內(nèi)容】

【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】

本發(fā)明旨在提供能以高的生產(chǎn)量制造天然型蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)的方法。

【解決課題的技術(shù)方案】

本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行銳意努力，以有高的產(chǎn)生重組抗體的能力的培養(yǎng)細(xì)胞株(CHO細(xì)胞株)作為材料，對(duì)于在所述細(xì)胞株中表達(dá)顯著的基因進(jìn)行檢查的結(jié)果，鑒定一種mRNA型非編碼RNA，其通過(guò)使用特定的小鼠序列作為探針而被識(shí)別。此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相當(dāng)于NfkBia的mRNA的非翻譯區(qū)域的互補(bǔ)鏈。又發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在重組培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)由此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的一部分的序列組成的核酸分子，顯著地升高所述培養(yǎng)細(xì)胞的重組多肽的產(chǎn)生能力。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述非編碼RNA的表達(dá)上調(diào)的高產(chǎn)生抗體的細(xì)胞中NfkBia的表達(dá)被抑制。再者，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有高的重組抗體產(chǎn)生能力的培養(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)NfkBia的表達(dá)被抑制。從而認(rèn)為，通過(guò)高表達(dá)控制培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的NfkBia的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可增加希望得到的多肽的生產(chǎn)量，從而完成本發(fā)明。