[發明專利]人造三維表皮模型、其構建方法和培養基

在審

• 申請號: 201610966069.9
• 申請日: 2016-11-01
• 公開（公告）號: CN108018256A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: 馮冰;魏少敏;馬來記
• 申請（專利權）人: 上海家化聯合股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張靜

本發明涉及一種人造三維表皮模型、其構建方法和培養基。具體涉及由分離出的正常人類表皮角質細胞和人工支架構建形成人造三維表皮模型的方法、以及該方法構建的人造三維表皮模型。本發明的構建人造三維表皮模型的方法采用添加有霍亂毒素和Fetal Clone II血清的培養基。

技術領域

本發明涉及一種構建人造三維表皮模型的方法，以及該方法構建的人造三維表皮模型。具體涉及由分離出的正常人類表皮角質細胞和人工支架構建形成人造三維表皮模型的方法以及該方法構建的人造三維表皮模型。本發明方法所構建的人造三維表皮模型的角質層分化明顯，并有多層角質層分化。

背景技術

皮膚藥物、日用化學品(洗滌劑、清潔劑)、化妝品與生活息息相關，它們的質量和安全應當有保障。對這些產品而言，皮膚刺激性是日常使用中最常見的不良反應之一，因此皮膚刺激性試驗是這些產品的安全性評價的主要項目。目前世界各國要求將這些產品，尤其是化妝品及其原料的皮膚刺激/腐蝕試驗列為安全評價的檢測內容。皮膚刺激/腐蝕試驗在傳統上采用實驗動物進行。但隨著人們道德要求的提高對動物福利的日益重視，對用于取代動物試驗的替代方法的需求日漸增加。

2010年，歐盟批準采用重組人三維皮膚模型替代方法來取代動物試驗以進行皮膚用藥和化妝品刺激/腐蝕試驗。2013年，歐盟禁止進口基于動物試驗的化妝品。由于是否采用動物試驗以外的替代方法已成為新的貿易壁壘，影響到進出口化妝品的檢驗檢疫，因此，提升我國對皮膚藥物、日用化學品以及化妝品的質量檢測水平，使其達到國際專業檢測水準勢在必行。基于以上現狀，人造三維皮膚模型在皮膚毒性檢測中具有廣闊的應用前景。

人造三維皮膚模型的組織結構和生理功能與正常皮膚組織十分相似，因而可作為良好的皮膚替代模型并在近年來被廣泛使用。人造三維皮膚模型分為體內動物試驗模型和體外人體皮膚刺激試驗模型兩種。體內動物試驗模型在醫學范疇內被應用于燒傷皮膚的移植與修復、皮膚病的發病機理、皮膚發育等研究；體外人體皮膚刺激試驗模型被作為受試品用于外來化學物質對皮膚的刺激和 腐蝕的急慢性反應研究。目前國內對人造三維皮膚模型的研究重點為體內研究。

體外人造三維皮膚模型是將體外培養的具有增殖能力的皮膚細胞種植于具有生物兼容性的高分子材料中，獲得與正常皮膚類似的可替代的三維皮膚。為了形成良好的體外人造三維皮膚模型，要對種子細胞、支架材料、組織構件這三方面入手進行研究。作為用于皮膚刺激/腐蝕試驗的表皮模型，通常的是使用原代角質細胞或者HaCaT永生化角質細胞作為種子細胞，將聚碳酸酯膜、牛膠原等材料作為支架進行培養，得到形成類似表皮的多層結構組織。

3R原則(Reduce(減少)、Replace(替代)、Refine(優化))促進了全球對體外皮膚模型的研究，但國內動物實驗成本低廉、取材廣泛，導致我國對取代動物試驗的替代方法的研究不夠重視、相對滯后。近十年來，國內化學品安全評價中使用它鼠、兔、豬等與人皮膚相似的動物作為試驗模型，而對體外人造三維皮膚模型的構建也在逐步展開。目前我國相關科研院所已經成功構建體外人造三維皮膚模型，以第三、第四軍醫大學為代表的機構對化學品刺激/腐蝕模型的研究著重于體外人造三維皮膚模型的構建；廣東進出口檢驗檢疫中心則著重于模型的探索構建、生物標志性研究以及毒性檢測中的應用評價等。但以上研究中各項化學物皮膚刺激試驗還未按照ECVAM(替代方法歐洲研究中心)發布的技術指南為標準進行驗證。

皮膚模型于90年代開始用于化妝品的替代試驗，到目前為止，商業化和即將商業化的皮膚組織檢測模型已達30余種。所有皮膚組織檢測模型均需要經歷預驗證-驗證-應用階段，在國外已經通過ECVAM預驗證、且適用于化妝品檢測的體外模型有：Episkin模型、EpiDerm模型、SkinEthic模型等。