[發(fā)明專利]一種用于凝血酶檢測的紙基適體熒光傳感器的構(gòu)建

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610966066.5
• 申請日: 2016-11-02
• 公開（公告）號: CN106526182B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘭飛飛;梁琳琳;葛慎光;于京華;顏梅
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N21/64
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 李茜

1.一種用于凝血酶檢測的紙基適體熒光傳感器的構(gòu)建方法，其特征是包括以下步驟：

1.1在計算機上設(shè)計紙芯片疏水蠟打印圖案，紙芯片疏水蠟打印圖案由兩個邊長為20mm的正方形組成，兩個正方形并排呈現(xiàn)且中間存在1mm寬的折疊區(qū)，左側(cè)正方形的左上角和右下角分別是直徑為8mm的圓形親水孵化區(qū)域和工作區(qū)域，右側(cè)正方形的右上角和左下角分別是兩個直徑為8mm的圓形孔洞區(qū)，折疊區(qū)處折疊后與左側(cè)圓形區(qū)域剛好重疊；

1.2將步驟1.1中設(shè)計的打印圖案通過蠟打印機打印在已裁剪為A4大小的色譜紙上，然后將帶有蠟圖案的A4色譜紙通過加熱到125oC的平板加熱器加熱2 min，使蠟融化并浸透整個紙的厚度，形成疏水墻，得到用于熒光測定的工作區(qū)域和用于熒光標記物和適配體反應(yīng)的孵化區(qū)域；

1.3將步驟1.2中得到的色譜紙的工作區(qū)域進行功能化，生長AuPt雙金屬后進行適配體1的修飾，滴加50 μL待檢測的凝血酶，反應(yīng)45 min后用磷酸緩沖溶液清洗，然后用牛血清白蛋白封鎖非活性位點；

1.4在步驟1.2中得到的色譜紙的孵化區(qū)域滴40 μL合成好的QDs@ZnO熒光標記物和 60μL的1 μM適配體2，進行熒光標記物和適配體2的反應(yīng)；

1.5將紙芯片沿著折疊線折疊，連有適配體2的熒光標記物QDs@ZnO到達含有目標物的工作區(qū)域，反應(yīng)30 min后用磷酸緩沖溶液洗滌；

1.6將步驟1.5中紙芯片工作區(qū)域放入熒光設(shè)備中，在340 nm的激發(fā)波長下進行熒光測定，繪制熒光強度與凝血酶的濃度關(guān)系，實現(xiàn)對凝血酶的精確檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于凝血酶檢測的紙基適體熒光傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟1.3中所述將步驟1.2中得到的色譜紙的工作區(qū)域進行功能化，步驟如下：用移液槍量取100 μL 金納米粒子滴于親水的工作區(qū)域，然后在室溫下自然干燥，重復(fù)5次，二次水洗滌，室溫下干燥靜置；將1.0 mL 1wt% 氯金酸水溶液和2.5 mL 1wt% 氯鉑酸溶液快速混勻，移液槍量取60 μL混合液滴加到工作區(qū)域，然后用移液槍迅速量取40 μL新鮮配制的1wt%檸檬酸鈉水溶液滴到工作區(qū)域，反應(yīng)30 min后用二次水沖洗，然后用移液槍量取100μL 1 μM 適配體1滴于工作區(qū)域孵化1 h, 用pH為 7.4 磷酸緩沖溶液清洗三次后用1wt%的牛血清白蛋白溶液封鎖非活性位點。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于凝血酶檢測的紙基適體熒光傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，在步驟1.4中所述的QDs@ZnO的制備步驟為：稱取0.3 g 炭黑溶于60 mL 6 M硝酸中，超聲2 h后在120 °C條件下回流24 h，將上述溶液降到室溫后離心并干燥，然后將產(chǎn)物溶于二次水后透析三天，得到石墨烯量子點;稱取3.5 g可溶性淀粉溶于80 mL沸水中，在85oC下攪拌5 min后加入6 mmol六水合硝酸鋅，通過逐滴加入氫氧化鈉將溶液pH調(diào)至8-9后繼續(xù)加熱30 min，然后將獲得的沉淀離心、洗滌并在500 oC下焙燒2 h獲得多孔氧化鋅，稱取0.6 g獲得的多孔氧化鋅溶于0.1 mM的對巰基苯胺溶液中攪拌4 h；移液槍量取500μL合成好的量子點與2 mL功能化的氧化鋅混合后在10 mg·mL^-1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和20 mg·mL^-1的 N-羥基丁二酰亞胺作用下反應(yīng)30 min，離心，洗滌后溶于3mL磷酸緩沖溶液中 。