[發明專利]一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法

有效

• 申請號: 201610956853.1
• 申請日: 2016-10-27
• 公開（公告）號: CN107064073B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 徐昕榮;朱斌;胡國成;黃思靜
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: G01N21/59
• 分類號: G01N21/59;G01N30/02
• 代理公司: 貴陽派騰陽光知識產權代理事務所(普通合伙) 52110
• 代理人: 管寶偉

1.一種水解膠原蛋白粉多肽分子量的快速測定方法，其特征在于，所述的測定方法主要包括以下步驟：

(1)將水解膠原蛋白粉和超純水按照1:5的體積比混合，攪拌30min，然后在5-10℃下，10000～12000r/min條件下離心1h，取出上清液，將上清液使用UF膜進行超濾濃縮，濃縮前后的體積比為5:1-2，將超濾濃縮后的粉濃縮液通過使用緩沖液經離子交換層析進行復溶，得到的復溶液經含Sephadex G-100凝膠色譜柱，以0.3-0.5mL/min流速進行分離純化，檢測波長為280nm，收集檢測器上顯示的各個峰的峰值管，洗脫，在5-10℃下收集洗脫液在真空環境下濃縮，濃縮前后體積比為5:1，然后進行噴霧干燥，得到分離純化的多肽，備用；

(2)將步驟(1)分離純化的多肽使用水解的酶解液混合溶解，攪拌后得到混合溶液，使用固形物含量檢測儀檢測混合溶液中的固形物含量，繼續添加酶解液并攪拌使混合溶液中固形物含量為3％并過濾，得到澄清的過濾液，將一部分澄清的過濾液備用，在另外一部分澄清過濾液中加入質量濃度為40％三氯乙酸溶液至三氯乙酸在澄清溶液中的最終濃度為15％，混和均勻后，在常溫、轉數3000rpm條件下離心15min，然后在300nm條件下進行透光率檢測，與未經過三氯乙酸處理的澄清過濾液作對比，使用分光光度計檢測透光率所占比例，從而判定得到的分離純化的多肽含量；

(3)采用水溶性體積排阻色譜柱，將緩沖液作為流動相，以0.8-1.4mL/min的流速，在合適的色譜檢測條件下，對從步驟(1)得到的多肽標準樣品測定，建立相應的標準圖譜，并由標準圖譜中分子的保留時間與分子量對數值之間存在的線性關系，所述的線性關系為：Y＝-0.525X+8.2036，其中X為多肽在色譜柱中的保留時間，Y為多肽的分子量的對數值，實現對多肽的分子量測算，同時利用所述色譜檢測條件對水解膠原蛋白粉樣品進行檢測，并依據檢測結果標準圖譜的對比，來快速檢測出多肽分子量；

所述的步驟(1)中的緩沖液為0.05mol/L pH7-7.5的Tris-硼酸平衡緩沖液；

所述的步驟(2)中的酶解液制備方法為：將洗凈、粉碎的魚鱗、蒸餾水、蛋白酶按照5:1000:3的質量比置入反應器中，攪拌5-10min后，調節pH值為6-7，加熱升溫，反應溫度在60-70℃酶解3-5h，酶解結束后升溫至90-100℃滅酶5-10min，滅酶結束后降溫至30-40℃，室溫下靜置30-60min，60目篩網過濾，濾除殘渣，收集濾液即為所述的酶解液；

所述的步驟(3)中的色譜檢測條件為：溫度為15-30℃，采用pH值為6.0-7.0的，濃度為100-200mM的磷酸鹽緩沖液作為流動相，且流速為0.8-1.2mL/min，檢測波長范圍設于260-300nm；

所述的多肽的分子量的對數值Y與小分子多肽在色譜柱中的保留時間X之間的線性關系中相關系數R²＝0.8657；

所述的水溶性體積排阻色譜柱為美國-SRT體積排阻色譜柱，PH范圍2-8.5。