[發明專利]基于納米金?DNA復合材料檢測蛋白質的方法

有效

• 申請號: 201610949304.1
• 申請日: 2016-10-26
• 公開（公告）號: CN106546749B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 陳鄭博;魏祥聰;譚路路
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/532
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君

1.基于納米金-DNA復合材料檢測蛋白質的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、納米金顆粒的制備：通過檸檬酸鈉還原氯金酸制得，氯金酸溶液濃度為50mM，氯金酸和檸檬酸鈉的摩爾比為3.5-3.8:1，所得溶液中納米金顆粒的平均粒徑為13-18nm；

S2、納米金-DNA復合物的制備：向上述含有納米金顆粒的溶液50μL中加入濃度為1μM的一端修飾有巰基的DNA溶液10μL，所述DNA為poly(A)₁₅，得到納米金-poly(A)₁₅復合物；

S3、向上述含有納米金-DNA復合物的溶液60μL中分別加入M1濃度的11種蛋白質溶液各50μL，于37℃孵育10min；同時以ddH₂O為空白對照，即向上述含有納米金-DNA復合物的溶液60μL中加入ddH₂O 50μL，于37℃孵育30min；

其中，所述11種蛋白質包括胰蛋白酶、牛血紅蛋白、牛血清蛋白、人血清蛋白、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、辣根過氧化酶、軟鐵蛋白、細胞色素-C、纖維原蛋白和刀豆球蛋白；

S4、納米金催化硝基苯酚和硼氫化鈉反應生成氨基苯酚：向S3所得溶液110μL中加入濃度為5mM的硝基苯酚溶液200μL和濃度為0.6M的硼氫化鈉溶液200μL，利用裸露的納米金表面催化其反應；

S5、目測觀察溶液由黃色變成無色的反應時間，即CCT值，分別記下不同蛋白質對應的CCT值，以及空白對照ddH₂O對應的CCT₀值，并分別計算不同蛋白質對應的CCT/CCT₀值，繪制表格；

S6、將所述DNA替換為poly(C)₁₅，重復S1～S5；

S7、將所述DNA替換為poly(T)₁₅，重復S1～S5；

S8、將針對上述三種DNA繪制的反應不同蛋白質CCT/CCT₀值的表格輸入軟件IBM SPSS Statistics 19，從而得到不同蛋白質對應的LDA圖；

S9、按照S1和S2分別制備針對上述三種DNA的納米金-DNA復合物溶液，分別向三種納米金-DNA復合物溶液60μL中加入M1濃度的待測蛋白質溶液50μL，于37℃孵育30min；同時以ddH₂O為空白對照；

S10、向S9所得溶液110μL中加入濃度為5mM的硝基苯酚溶液200μL和濃度為0.6M的硼氫化鈉溶液200μL，進行反應；目測觀察溶液由黃色變成無色的反應時間，并計算CCT/CCT₀值，代入S8所述軟件中，根據LDA圖顯示結果，對待測蛋白質進行識別；

步驟S3和S9中，300nM≤M1≤2000μM；

所述poly(A)₁₅是由15個堿基A組成的DNA片段，所述poly(C)₁₅是由15個堿基C組成的DNA片段，所述poly(T)₁₅是由15個堿基T組成的DNA片段。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，S3中每種蛋白質做5～6個重復。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，M1為300nM或500nM。

4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，S9中各反應試劑的用量及反應條件同S3；S10中各反應試劑的濃度、用量及反應條件同S4。