[發明專利]一種β半乳糖苷酶的酶供體偶聯物及其在甘膽酸檢測中的用途

有效

• 申請號: 201610946486.7
• 申請日: 2016-10-26
• 公開（公告）號: CN106565809B
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 封建新;龔俊;張啟飛;高秋峰;王貴利;劉希
• 申請（專利權）人: 北京九強生物技術股份有限公司
• 主分類號: C07J41/00
• 分類號: C07J41/00;C07J43/00;C12N9/38;G01N33/53;G01N21/78
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司11314
• 代理人: 程偉,程云

技術領域

本申請涉及臨床檢驗、生物學領域。更具體地，涉及一種檢測血清中甘膽酸含量的方法，以及還涉及一種β半乳糖苷酶的酶供體偶聯物。

背景技術

血清甘膽酸(Cholyglycine，CG)是膽酸與甘氨酸結合而成的結合型膽酸之一。在肝細胞內，膽固醇經過及其復雜的酶促反應，轉變成初級膽汁酸，其中有膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(CDCA)。膽酸與甘氨酸結合即形成甘膽酸。

CG正常代謝途徑為腸肝循環，CG由肝細胞合成后，經毛細膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進入十二指腸，幫助食物消化。95％膽酸在回腸末端重吸收，經門靜脈再回肝臟，由肝細胞攝取再利用。在血清中主要以蛋白結合形式存在，溢入體循環的總量小于1％。

在正常情況下，外周血中膽酸含量甚微，正常成人無論是空腹還是餐后，其血清CG濃度穩定在低水平。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，而返流血液循環的CG含量增高，也使血CG含量增高。測定血清甘膽酸(SCG)是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能的敏感指標之一。

克隆酶供體免疫檢測(Enzyme Donor Immunoassay，CEDIA)是一種均相的免疫檢測技術，結合了β半乳糖苷酶α互補原理和抗原抗體的特異性結合性質。將小分子抗原(Ag)與酶供體(ED)偶聯，形成ED-Ag偶聯物，此偶聯物能與酶受體(EA)自發結合形成有活性的β半乳糖苷酶；但是如果在反應體系中加入針對該小分子抗原的抗體(Ab)，抗原抗體的特異性結合會形成ED-Ag-Ab復合物，此時由于抗體空間位阻的影響，ED-Ag-Ab復合物不能再與EA結合形成具有活性的β半乳糖苷酶。如果血清中含有待檢測的小分子抗原，此時反應體系中含有兩種形式的抗原，一種是血清中的游離抗原，一種是試劑盒中與ED偶聯的抗原，即ED-Ag偶聯物，這兩種形式的抗原都具有與抗體特異性結合的能力。顯然，這兩種形式的抗原會競爭性的與反應體系中的抗體結合，血清中游離抗原越多，其結合的抗體就越多，從而導致有更多的剩余ED-Ag偶聯物(未與抗體結合的部分)能與EA自發結合形成具有活性的β半乳糖苷酶，且酶活性的高低與血清中游離抗原的含量成正比。

臨床測定血清甘膽酸的常規方法包括化學發光(CLIA)和酶聯免疫(ELISA)。前者靈敏度高，但是需要昂貴的化學發光儀器；后者操作繁瑣，檢測時間長，自動化程度低，重復性較差。

新近出現的一種基于EMIT的甘膽酸檢測方法(CN103760348A)，是一種均相免疫檢測方法，可以在全自動生化儀上進行血清甘膽酸含量的高通量檢測，但是特異性和試劑熱穩定性有待改進。

發明內容

為了給臨床提供更有價值的診斷信息，根據本公開的一些實施方案，提供了一種甘膽酸衍生物，其如通式(I)所示：

其中n為0至20之間的任意整數，例如但不限于n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更優選n為2、3、4、5或6；

X為能與巰基發生反應的基團，例如但不限于馬來酰亞胺、溴乙?；?、乙烯基砜、氮丙啶。在一個具體的實施方案中，X是馬來酰亞胺。

在一些具體的實施方案中，提供甘膽酸衍生物，其如通式(II)至(V)中任一項所示：

根據本申請的甘膽酸衍生物能與β半乳糖苷酶的酶供體(以下簡稱ED)分子按照1：1摩爾比定向偶聯。

在本申請中，任何已知的或未來的β半乳糖苷酶的酶供體均適用于實施本申請的技術方案，只要能夠和酶受體結合后能夠具有β半乳糖苷酶活性即可(酶活性是指：能夠催化底物顯色)。例如，野生型β半乳糖苷酶的酶供體、或者經工程改造的β半乳糖苷酶的酶供體(比如CN105524898A中公布的酶供體)。

根據一些實施方案，提供一種偶聯物，其由本申請的甘膽酸衍生物與ED分子偶聯而成。在本申請的上下文中，還可以稱為“ED-甘膽酸偶聯物”。這種偶聯物能被甘膽酸的特異性抗體(單抗或多抗)識別，也能與EA分子互補形成具有活性的全酶。