[發明專利]一種馬克思克魯維酵母質粒載體及其應用

在審

• 申請號: 201610944729.3
• 申請日: 2016-11-02
• 公開（公告）號: CN108004263A
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發明（設計）人: 李十中;李鵬松;仉磊;付曉芬
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/65;C07K14/435
• 代理公司: 北京匯知杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11587
• 代理人: 蔡倫

本發明公開了一種馬克思克魯維酵母質粒載體，所述質粒載體含有馬克思克魯維酵母自主復制和著絲粒序列CEN/ARS；所述質粒載體的開放閱讀框采用ADH1啟動子和ADH1終止子；所述質粒載體的選擇標記為KanMX6基因；所述質粒載體能夠在馬克思克魯維酵母中自主復制并用于內源或外源目的基因的表達。

技術領域

本發明涉及酵母基因工程領域，尤其涉及一種馬克思克魯維酵母質粒載體，能夠在馬克思克魯維酵母中自主復制并用于內源或外源基因的表達。

背景技術

馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）在分類學上與釀酒酵母具有一定的親緣性，其能在40℃以上生長并進行乙醇發酵，并獲得美國的GRAS和歐洲的QPS安全認證。與釀酒酵母相比，馬克思克魯維酵母因其生長速率快、耐高溫、可利用底物廣泛和蛋白分泌能力強等優點而備受工業生產的青睞。為了能使馬克思克魯維酵母獲得更加優良的性狀，需要特定的載體對其進行分子生物學改造。

酵母的載體系統包括整合型載體、附加型載體、復制型載體和著絲粒載體等。整合型載體缺乏酵母的復制起始位點，不能在酵母中自主復制，但其具有整合介導區，可以整合到酵母染色體并穩定遺傳。附加型載體通常含有釀酒酵母2μ質粒的DNA復制相關序列，拷貝數高達60-100，轉化效率高。復制型質粒含有源于酵母染色體的自主復制序列（autonomously replicating sequence,ARS），ARS含有酵母中DNA進行雙向復制所必須的信號，使這種載體能在酵母染色體外自主復制，拷貝數可達上百個，且轉化效率也較高。著絲粒載體含有酵母染色體著絲粒的DNA片段CEN，CEN是有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點。著絲粒載體在細胞分裂過程中，在母細胞和子細胞之間平均分配，表現出高度的穩定性。

作為模式生物，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）擁有豐富的載體系統。雖然馬克思克魯維酵母與釀酒酵母之間存在一定的親緣關系，但釀酒酵母中的常用載體往往不能在馬克思克魯維酵母中正常使用。因此，提供一種可在馬克思克魯維酵母中穩定自主復制并用于內源或外源目的基因表達的質粒載體是本領域急需解決的問題。

發明內容

本發明提供了一種馬克思克魯維酵母質粒載體，其可在馬克思克魯維酵母中自主復制并用于內源或外源目的基因的表達，所述質粒載體含有馬克思克魯維酵母自主復制和著絲粒DNA序列CEN/ARS，如SEQ ID No.1所示。

在一個實施方案中，啟動子為ADH1啟動子，終止子為ADH1終止子。

在一個實施方案中，所述質粒載體包含選擇性標記，優選G418抗性基因KanMX6。

在一個優選實施方案中，所述質粒載體的核酸序列如SEQ ID No.2所示。

在另一個實施方案中，所述質粒載體還包含目的基因。

在一個優選實施方案中，所述目的基因構建在ADH1啟動子與ADH1終止子之間的一個限制性酶切位點上或者構建在ADH1啟動子與ADH1終止子之間的兩個限制性酶切位點（例如SmaI和XhoI）之間。

在一個更優選的實施方案中，所述ADH1啟動子與目的基因之間還包含Kozak序列GCCACC。

本發明還提供所述馬克思克魯維酵母質粒載體用于目的基因在酵母中表達的應用。

在一個實施方案中，所述目的基因為綠色熒光蛋白基因。

本發明提供的馬克思克魯維酵母質粒載體可以在馬克思克魯維酵母中自主復制并用于內源或外源目的基因的表達。

附圖說明

圖1是pKmLP2質粒圖譜。

圖2是表達GFP馬克斯克魯維酵母的明場與熒光顯微圖像。

具體實施方式