[發明專利]一種高同型半胱氨酸血癥誘導肝臟纖維化模型的建立方法

有效

• 申請號: 201610944032.6
• 申請日: 2016-11-02
• 公開（公告）號: CN106577476B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 唐博;李全忠;齊廣瑩;梁興思;蔡雄;王林青
• 申請（專利權）人: 唐博
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02;A61K31/7088;A23K50/50;A23K20/142
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

1.一種高同型半胱氨酸血癥誘導肝臟纖維化模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、制備體內高蛋氨酸飲食誘導高同型半胱氨酸血癥模型：

步驟2、高同型半胱氨酸血癥通過USP22誘導肝臟纖維化，建立高同型半胱氨酸血癥誘導肝臟纖維化模型；

所述步驟1中的制備體內高蛋氨酸飲食誘導高同型半胱氨酸血癥模型具體為：

步驟1.1、選擇20只6-8周齡的C57BL/6小鼠，隨機分成2組，每組10只，一組為正常組，喂養正常的飼料，一組為造模組，喂養含質量百分含量為2％的高蛋氨酸飼料，2周后，處死小鼠，下腔靜脈采血，收集小鼠的血液檢測同型半胱氨酸的水平，收集小鼠肝臟組織進行馬松染色評估肝臟纖維化的情況，蛋白印記法，免疫組化法檢測膠原蛋白I的表達情況，如果馬松染色結果看到造模組明顯纖維化，免疫組化看到造模組中細胞胞外，胞質中膠原蛋白I表達明顯，具有明顯的統計學意義，則造模成功；

步驟1.2、確定體內HCY誘導肝星狀細胞纖維化的最佳處理時間：正常培養的肝星狀細胞，采用初定濃度為24μM同型半胱氨酸預處理，分別12h，24h，48h，72h后收集細胞，采用蛋白印記法，免疫熒光法檢測膠原蛋白I的表達情況；

步驟1.3、確定處理濃度：正常培養的肝星狀細胞，采用濃度為6-48μM同型半胱氨酸預處理，48小時后收集細胞，采用蛋白印記法，免疫熒光法檢測膠原蛋白I的表達情況；

所述步驟2中的高同型半胱氨酸血癥通過USP22誘導肝臟纖維化，建立高同型半胱氨酸血癥誘導肝臟纖維化模型具體為：

步驟2.1、體內：采用蛋白印記法，免疫組化法檢測泛素水解酶22在正常小鼠和肝臟纖維化小鼠肝臟組織中的表達情況，模型組中尾靜脈注射siRNAUSP22預處理，下調泛素水解酶22在纖維化小鼠肝臟中的表達，收集肝臟組織進行HE，馬松染色評估肝臟纖維化的情況，蛋白印記 ，免疫組化檢測泛素水解酶22、膠原蛋白I的表達情況；

步驟2.2、體外：采用蛋白印記法，免疫熒光法檢測肝星狀細胞中泛素水解酶22的表達情況，肝星狀細胞模型組內轉染si RNA，下調泛素水解酶22在肝星狀細胞中的表達，收集肝星狀細胞進行蛋白印記 ，免疫熒光法檢測泛素水解酶22，膠原蛋白I的表達情況。