[發明專利]一種快速提取棉花單粒種子的方法

在審

• 申請號: 201610924392.X
• 申請日: 2016-10-30
• 公開（公告）號: CN108004231A
• 公開（公告）日: 2018-05-08
• 發明（設計）人: 鄒杰
• 申請（專利權）人: 湖北綠安生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種快速提取棉花單粒種子的方法，屬于分子生物技術領域。本發明選用萌動的單粒棉種種仁作為提取材料，直接在裂解液中打碎、裂解，經過多次離心、沉淀，提取得到棉花種子。該方法操作簡便，可快速進行大批量提取，耗時少、提取過程中減少化學試劑的使用，減少了污染，適用于利用SSR標記快速鑒定棉花品種純度過程中樣品的獲得。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種快速提取棉花單粒種子的方法。

背景技術

近年來，分子標記技術越來越廣泛地應用于作物種子純度及品種真實性檢測研究中，而影響分子標記鑒定效率的瓶頸是的提取。棉花分子純度檢測中，一般是從棉株葉片中提取樣品，由于棉花幼苗培養周期較長，所以利用葉片提取的方法不能滿足于商業化生產中棉花種子純度快速鑒定的要求。而直接利用種子提取無疑將會縮短種子純度檢測的時間，但作物種子中富含蛋白、淀粉等物質，因而增加了提取的困難。棉花種子除富含蛋白外，還含有棉酚、多糖、單寧等次生代謝物，這些代謝物在細胞破裂時容易氧化，且氧化后與蛋白質、核酸等發生不可逆反應，形成棕色膠狀復合物，因此棉花種子提取的步驟較其他作物更為復雜。隨著植物提取技術的不斷發展，種子提取技術也在逐步完善。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡單、安全、快速的提取棉花種子的方法，以解決傳統方法中棉花種子提取過程繁瑣、耗時較長的問題，滿足種子純度快速鑒定的需要。

本發明提供一種提取棉花單粒種子的方法，包括以下步驟：

1）將棉花種子于水中浸泡至種仁松軟后，剝掉種皮，得到萌動松軟的種仁；

2）將步驟1）得到的種仁加入裂解緩沖液中，粉碎；

3）水浴、離心、取上清液，加入異丙醇，混勻；

4）離心，用乙醇洗滌沉淀，干燥；

5）加雙蒸水溶解，再次離心，取上清液，得到。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，實施例中所用的生化試劑均為市售。

以棉花品種魯棉研37號和魯6269為實驗材料，通過具體實例對本發明做進一步的描述。具體實例統一采用10μl PCR擴增體系，具體組分及程序如下。取1.2μl PCR擴增后產物，用濃度為8%的非變性PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）電泳檢測。

實施例1

本發明方法提取的樣品的稀釋倍數對PCR擴增的影響

（1）提取

將魯棉研37號的干種子泡在水中，室溫條件下浸泡20小時種仁松軟后，選取12粒種子，剝掉種皮，將萌動的種仁放入12個2ml離心管中，每管再加入700μl裂解緩沖液（組成成分：2%CTAB，0.02mol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl，2%PVP,1%β-巰基乙醇），粉碎。60℃水浴25min，間隔10min左右輕搖一次。10000r/min離心9min，取500μl上清液，加入0.8倍體積預冷的異丙醇，混合均勻，12000r/min離心2min，倒掉上清液，加入1ml70%乙醇洗滌沉淀，空氣中干燥30min后，加入200μl雙蒸水，用槍頭攪勻使溶解，溶解30min后。12000r/min離心1min，取150μl上清液，上清液即為提取樣品。

（2）擴增