[發明專利]新型蛇足石杉來源的賴氨酸脫羧酶及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201610917305.8
• 申請日: 2016-10-21
• 公開（公告）號: CN107974444B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 肖友利;徐寶福
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12P17/12;C12Q1/527;C12Q1/26
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發明涉及新型蛇足石杉來源的賴氨酸脫羧酶及其編碼基因和應用。具體而言，本發明提供一種多肽，選自：(1)SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示的多肽序列；和(2)在(1)所述的多肽序列中經過插入、缺失或突變一個或幾個氨基酸且具有賴氨酸脫羧酶活性的由(1)衍生的多肽；和(3)由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列與促進SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列表達、分泌到胞外或純化的多肽序列組成的多肽。本發明首次從蛇足石杉中鑒定到賴氨酸脫羧酶，并驗證體外和體內活性。利用該賴氨酸脫羧酶應可提高石松類生物堿尤其石杉堿甲的產量，因此具有較好的應用前景。

技術領域

本發明涉及新型蛇足石杉來源的賴氨酸脫羧酶及其編碼基因和應用。

背景技術

石杉堿甲是從中國傳統草藥千層塔(石松類石松屬植物種蛇足石杉)提取出來的石松類生物堿，其是乙酰膽堿酯酶的有效抑制劑，具有治療老年癡呆癥巨大應用前景。石杉堿甲的生物合成途徑的研究一直是困擾眾多國內外研究者的難題，之前放射性同位素喂養的實驗預測出了其分子結構水平的合成途徑，此途徑指出賴氨酸脫羧酶(LDC)以及銅胺氧化酶(CAO)是兩個石松類生物堿合成的起始步驟。CAO已經被其他研究人員鑒定，但本領域尚未鑒定到富產石杉堿甲的蛇足石杉來源的LDC。

發明內容

本發明利用兼并引物以及快速擴張cDNA末端的方法獲得6個全新的來源于蛇足石杉的編碼LDC的序列。此外，本發明在體外以及體內進行了偶聯反應，建立了定量檢測反應中間體的方法。

本發明第一方面提供一種多肽，選自：

(1)SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示的多肽序列；

(2)在(1)所述的多肽序列中經過插入、缺失或突變一個或幾個氨基酸且具有賴氨酸脫羧酶活性的由(1)衍生的多肽；和

(3)由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列與促進SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列表達、分泌到胞外或純化的多肽序列組成的多肽。

本發明第二方面提供一種多核苷酸序列，選自：

(1)編碼本發明第一方面所述多肽的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互補序列。

在一個或多個實施方案中，所述多核苷酸序列選自SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13所示的核苷酸序列。

本發明第三方面提供一種核酸構建物，其含有本發明第二方面所述的多核苷酸序列。

在一個或多個實施方案中，所述核酸構建物是表達載體。

本發明第四方面提供一種宿主細胞，其含有本發明的核酸構建物，如表達載體。

本發明第五方面提供本發明多肽、多核苷酸序列、表達載體在制備石松類生物堿尤其是石杉堿甲中的應用。

本發明第六方面提供一種檢測LDC的酶催化產物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯來檢測待檢測的反應體系中的尸胺的步驟。

本發明第七方面提供一種檢測CAO的酶催化產物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯來檢測待檢測的反應體系中的5-氨基戊醛的步驟。

本發明第八方面提供一種檢測LDC和CAO的酶催化產物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯來檢測待檢測的反應體系中的尸胺和5-氨基戊醛的步驟。

在第六方面的一個或多個實施方案中，所述方法包括向待檢測的反應體系中加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反應后檢測下式所示的衍生物A的存在和/或含量：