[發明專利]抗Ttyh1單克隆抗體及其應用

有效

• 申請號: 201610916107.X
• 申請日: 2016-10-20
• 公開（公告）號: CN106543285B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 鄭敏化;曹秀麗;韓驊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K16/30;C12N15/13;C12N5/0797;G01N33/68;G01N33/574;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所61216
• 代理人: 史玫

技術領域

本發明屬于干細胞技術領域，涉及一種抗Ttyh1單克隆抗體(FMMU-Ttyh1-11#)及其應用，本發明的抗體可特異性標記小鼠神經干細胞，并標記人膠質瘤組織中的TTYH1蛋白。

背景技術

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)基于其多向分化潛能，以及神經元損傷后的不可再生性，可望成為干細胞移植或誘導分化后回輸等治療手段的主要細胞來源，對中樞神經系統損傷及退行性變等疾病的治療具有重要意義。因此，神經干細胞特異性標志物的篩選，可為神經干細胞的標識、分離、純化和鑒定奠定基礎，成為生命科學和醫學研究領域的研究熱點。此外，在神經膠質瘤組織中，也會存在一些具有干細胞特性的腫瘤細胞，被稱為膠質瘤干細胞，其在自我更新、增殖和分化方面具有某些和神經干細胞類似的特性，可能受到共同的分子機制調控，并具有相同的標志物。尋找到這些新的腫瘤干細胞標志物，有望為神經系統腫瘤的治療提供新方法和新靶點。

發明內容

發明人在研究中發現Ttyh1基因特異性表達于小鼠神經干細胞。該基因在果蠅中的同源基因命名為tweety，最初是在flightless基因組位點上發現的。果蠅中的基因缺失研究表明tweety與其他兩個鄰近的基因dodo和penguin的同時缺失，會顯著降低果蠅生存能力，具有重要的生理意義。脊椎動物基因組中含有Ttyh1、Ttyh2、Ttyh3三種基因，它們進化上高度保守。其中，人、大鼠和小鼠的Ttyh1基因所編碼的氨基酸序列具有高度一致性，并且N端糖基化位點也是保守的，提示其具有相似的生物學功能。人類Ttyh1基因位于19q13.4，預測含5個跨膜區。編碼的蛋白包含450個氨基酸，C端含有豐富的帶負電荷的氨基酸殘基，可結合鈣離子。小鼠Ttyh1基因位于7號染色體，在腦、眼、脊髓和睪丸中高表達，在胰腺、垂體、乳腺和肝臟中表達較低。多項研究表明該基因家族對包括人類在內的脊椎動物的生理、病理活動具有重要調控作用。

抗體單體分子是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)，通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。H鏈和L鏈包括氨基端(N)和羧基端(C)，靠近N端的可變區(V區)由高變區/互補決定區(HVR/CDR)和骨架區(FR)組成；靠近C端為恒定區(C區)。重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)形成的蛋白質折疊是抗原結合部位，其中的CDR/HVR是抗體與抗原決定基互補結合的部位。本發明抗體選擇的抗原片段位于預測的Ttyh1蛋白第二跨膜區與第三跨膜區之間，理論上暴露于質膜外，更容易與抗體結合。

發明人使用本發明抗體進行的體內、體外染色實驗顯示：抗體在體內可以特異性標識小鼠神經干細胞，在細胞染色后位于小鼠源性的原代神經干細胞的胞漿與胞膜。采用小鼠原代神經組織的蛋白提取物行免疫印跡實驗顯示抗體可識別內源性Ttyh1蛋白(54KD)。另一方面，由于所選抗原的氨基酸序列與人類TTYH1蛋白序列高度同源，本發明抗體可在人類神經膠質瘤組織中標識TTYH1蛋白，有利于進一步揭示TTYH1在膠質瘤發生發展中的作用與機制，并在此基礎上發展具有診斷與治療價值的基因工程抗體。

本發明提供的抗Ttyh1單克隆抗體，包括重鏈和輕鏈，所述輕鏈可變區的3個互補決定區(CDR)序列分別為：

CDR1：Glu-Ser-Val-Asp-Asn-Tyr-Gly-Ile-Ser-Phe；

CDR2：Ala-Ala-Ser；

CDR3：Gln-Gln-Ser-Lys-Glu-Val-Pro-Arg-Thr；

所述重鏈的可變區的3個互補決定區(CDR)序列分別為：

CDR1：Gly-Phe-Asp-Phe-Ser-Arg-Tyr-Trp；

CDR2：Ile-Asn-Pro-Asp-Ser-Ser-Thr-Ile；

CDR3：Ala-Arg-Arg-Tyr-Ala-Tyr-Asp-Asp-Tyr。

本發明的編碼Ttyh1單克隆抗體輕鏈可變區的基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，編碼重鏈可變區的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示。

本發明的抗Ttyh1單克隆抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

本發明的抗體可特異性標識小鼠神經干細胞，為標記、分離、純化及鑒定小鼠神經干細胞提供有利工具。本發明抗體同時可標識膠質瘤組織中的人源性TTYH1蛋白，為TTYH1在膠質瘤中的基礎與轉化醫學研究提供支持。