[發明專利]一種絲氨酸129位磷酸化alpha?突觸核蛋白聚集體的ELISA檢測方法

有效

• 申請號: 201610913085.1
• 申請日: 2016-10-19
• 公開（公告）號: CN106568969B
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發明（設計）人: 楊慧;段春禮;邢昊;高歌
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N5/20;C07K16/18;C07K14/47
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙)11130
• 代理人: 王為,孟旭

技術領域

本發明涉及聚集化的絲氨酸129位磷酸化alpha-突觸核蛋白(α-syn)檢測方法的建立。

背景技術

帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)作為最常見的神經退行性疾病之一，分別影響65歲和85歲年齡中1％和5％的人口，alpha-突觸核蛋白(α-syn)作為2014年新修訂的對PD定義的核心蛋白，已引起人們高度重視α-syn在PD早期診斷、病程和藥物療效檢測中的實際應用。因此，現在急需一種或多種靈敏且特異的檢測方法，檢測各種形式的α-syn隨著PD的發生發展在人體液中的變化趨勢，這就要求這種檢測方法要客觀、可行，并易于在臨床上得以推廣。路易體(Lewy’s Body,LB)作為PD主要的病理標志物，其主要成分由α-syn組成，而在LB中有90％的α-syn在129位發生了磷酸化(pS129-α-syn)。為了研究PD病程的進展，人們利用了多種方法監測α-syn在體內的變化趨勢，縱觀近幾年的檢測α-syn的文獻，報道PD患者體液中的α-syn含量不盡相同，但是磷酸化α-syn和α-syn聚集體的含量增加是基本一致的報道。在上述有意義的研究報道中，檢測的磷酸化α-syn是單體形式和α-syn的聚集體形式，而沒有明確聚集體中α-syn是磷酸化形式還是非磷酸化形式，更沒有檢測聚集狀態的磷酸化α-syn，因為目前尚沒有檢測聚集化pS129-α-syn的方法。而聚集的磷酸化α-syn在PD發生發展過程中發揮更關鍵的作用。而且有文獻報道，活性醛類——包括ONE(4-oxo-2-nonenal),HNE(4-hydroxynonenal)——在PD患者的腦脊液中的含量隨疾病進展而不斷升高，它們作為脂質過氧化的產物，可以與α-syn的第50位組氨酸發生加合(如下)。而促使α-syn更易發生聚集。考慮到建立標準曲線所需使用的標準抗原的單一性，本專利使用HNE的氧化副產物(Oxidative Counterpart)ONE促進人源α-syn和pS129-α-syn發生聚集，建立基于夾心法ELISA的檢測方法，以便將來觀察臨床腦脊液、血漿、大腦勻漿中聚集化的pS129-α-syn隨病程的變化趨勢。

HNE和蛋白質的組氨酸通過1,4-Michael加合對蛋白進行翻譯后修飾

因此，我們發明的聚集化絲氨酸129位磷酸化α-突觸核蛋白的檢測方法具有重要意義。為臨床PD的血液及腦脊液樣品及基礎研究的PD模型的聚集化絲氨酸129位磷酸化α-突觸核蛋白的檢測提供了檢測手段，也有可能通過此方法建立PD的診斷試劑盒。

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。加入酶標記的抗原或抗體，通過反應也結合在固相載體上。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據呈色的深淺進行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:

1)將特異性抗體與固相載體聯結,形成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質，

2)加受檢標本,保溫反應，標本中的抗原與固相抗體結合,形成固相抗原抗體復合物，洗滌除去其他未結合物質，

3)加酶標抗體,保溫反應，固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合，徹底洗滌未結合的酶標抗體，此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關，

4)加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產物，通過比色,測知標本中抗原的量，這種雙位點夾心法具有很高的特異性。

在臨床檢驗中,雙抗體夾心法法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清,包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體,一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結合物。