[發明專利]一株產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法與應用

有效

• 申請號: 201610912145.8
• 申請日: 2016-10-19
• 公開（公告）號: CN106635940B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 李丕武;郝李振;王瑞明
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學;諸城東曉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P19/26;C12R1/125
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 朱家富

本發明涉及一株產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法與應用。構建方法為：將來自釀酒酵母的GFA1基因、glms核糖開關基因和EGFP增強型熒光蛋白編碼基因轉化至枯草芽孢桿菌中，構建獲得產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌。本發明首次將glms核糖開關和EGFP基因連接在PHT01中，構建成GLMS－EGFP傳感器，響應枯草芽孢桿菌細胞內6?磷酸氨基葡萄糖量的變化而表現出熒光強度的變化，通過流式細胞儀，可以實時掌握氨基葡萄糖的合成情況。

技術領域

本發明涉及一株產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法與應用，特別涉及一株利用glms核糖開關構建產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的方法及應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

氨基葡萄糖(GlcN)是一種天然存在于結締組織和胃腸道粘膜中的氨基單糖，內源性GlcN在動物和人體細胞內由葡萄糖轉化生成，可以合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖，特別是合成關節軟骨以及滑液分子的中間物，臨床試驗表明，外源性氨糖對于人體和動物體內的骨關節炎具有很好的療效，此外還具有抗腫瘤活性等生理功能。目前商品化的GlcN幾乎全部是來自蝦、蟹等甲殼原料的高溫水解，生產過程需要高溫和強酸處理，排放的廢液嚴重污染環境，因此尋找一株安全生產GlcN的微生物，利用生物法合成GlcN具有重要意義。利用微生物發酵直接合成GlcN的優勢主要有：1)生產原料來源簡單，獲取不受地域限制；2)轉化條件溫和，不需高溫、高壓過程，能耗低；3)生產過程中無需加入強酸、強堿，不產生高鹽廢水，對環境污染小；4)產品無魚腥味及微量致敏性物質，不會對體質過敏者造成過敏反應，更適合于在醫藥和保健領域的應用。

中國專利文獻CN104195094A(申請號201410376584.2)公開了一種生產N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢桿菌及其構建方法和應用。該基因工程菌通過在枯草芽孢桿菌中表達編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因，形成完整的從葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代謝通路；敲除或失活枯草芽孢桿菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑中的6-磷酸氨基葡萄糖脫氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖轉運蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖轉運蛋白基因nagP構建而成，它解決了現有技術中所生產的N-乙酰氨基葡萄糖安全性差、產量低、成本高的問題。但其無法解決在發酵過程種實時檢測氨基葡萄糖變化的問題。

glms核糖開關是至今發現的唯一能夠調控糖代謝的核糖開關，只存在于革蘭氏陽性菌中，位于編碼glmS的mRNA的5'UTR內，它需要小分子物質GlcN-6P才能激活，這在已經發現的核酶中是非常少見的，目前對glms核糖開關的相關研究較少。

發明內容

本發明針對先游戲技術的不足，提供一株產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法與應用。該方法利用glms核糖開關基因并以此構建了一株產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌株，該菌株可應用于GlcN的合成。

本發明技術方案如下：

一株產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌的構建方法，其特征在于，將來自釀酒酵母的GFA1基因、glms核糖開關基因和EGFP增強型熒光蛋白編碼基因轉化至枯草芽孢桿菌中，構建獲得產氨基葡萄糖枯草芽孢桿菌；

所述glms核糖開關基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EGFP增強型熒光蛋白編碼基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GFA1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根據本發明優選的，所述構建方法，具體步驟如下：

(1)提取大腸桿菌中的質粒pEGFP-N1，以質粒pEGFP-N1為模板，使用引物EGFP-F和EGFP-R進行PCR擴增，制得EGFP增強型熒光蛋白編碼基因；所述引物核苷酸序列如下：

EGFP-F:CTTCTTTTTAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA；

EGFP-R:TCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA；