[發明專利]葛根在促進骨髓間充質干細胞遷移方面的應用

在審

• 申請號: 201610910934.8
• 申請日: 2016-10-19
• 公開（公告）號: CN107970274A
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 宋小莉
• 申請（專利權）人: 山東中醫藥大學
• 主分類號: A61K36/488
• 分類號: A61K36/488;A61K35/28;A61P1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于再生醫學和中藥藥理學領域，涉及一種中藥葛根的用途，特別涉及葛根在促進骨髓間充質干細胞遷移方面的新用途。

背景技術

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是存在于骨髓中具有″無限″增殖和多向分化潛能的干細胞。在一定的誘導條件下，這類細胞可歸巢到特定的組織并分化為相應組織細胞，發揮修復重建作用。

臨床及動物實驗均顯示出BMSCs移植治療UC疾病具有可靠的療效，可以很好的修復潰瘍受損組織，應用BMSCs移植治療UC已經成為UC治療的新途徑。

但目前臨床應用BMSCs治療疾病時多采用靜脈給藥的方式進行移植，BMSCs遷移至損傷組織的效率較低，治療過程中存在遷移不足等問題，因此提高干細胞注射后向損傷組織的歸巢成為影響干細胞療效的關鍵因素。

葛根，為豆科植物野葛的干燥根。歸肺、胃經。有解肌退熱，透疹，生津止渴，升陽止瀉之功效。具有解熱、擴張血管、降血糖、降血脂、改善記憶力、解酒等藥理作用。

迄今未見國內外對葛根在促進骨髓間充質干細胞誘導遷移治療UC方面的研究報道。

發明內容

本發明公開了葛根的一種新用途，發現葛根聯合骨髓間充質干細胞治療潰瘍性結腸炎(UC)具有增效作用，葛根可以提高骨髓間充質干細胞向潰瘍組織結腸的遷移，且其促進遷移的機制與提高潰瘍組織SDF的表達有關。

附圖說明

圖1為各組大鼠體重變化情況圖。

圖2各組大鼠CMDI、TDI評分結果。

圖3 CM-DiI標記的BMSCs在UC模型大鼠腸道內定植情況。

圖4各組大鼠結腸組織SDF-1 mRNA表達水平。

具體實施方式

本發明的技術方案具體實施包括以下內容。

大鼠BMSCs體外分離與原代培養：SD大鼠脫頸椎處死，完全浸泡于75％酒精中3min，無菌條件下，無菌條件下分離大鼠雙側股骨及脛骨，并剝離附著其上的肌肉組織，置于盛有生理鹽水的無菌培養皿中，在超凈臺內，用酒精、PBS各沖洗2遍，去除兩端骨髓，暴露骨髓腔，用5ml注射器吸取含10％胎牛血清的L-DMEM培養液反復沖洗，至骨髓腔變白，收集沖洗液接種于培養瓶中，置于37℃，體積分數為5％CO2、飽和濕度培養箱中培養。培養48h后半量換液，72h全量換液，之后每2d換液一次，并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態及生長情況。

傳代培養：當細胞緊貼培養瓶壁生長至80％～90％融合，可進行傳代培養。首先棄去舊培養基，用無菌D-Hanks緩沖液漂洗2次，再加入0.25％胰酶室溫消化1min左右，待細胞形態變圓時加入等量的10％胎牛血清的L-DMEM培養基終止消化，并用吸管反復吹打，按1∶2比例等量接種于培養瓶中，繼續培養，24h后半量換液，48h全量換液，后每2d換液一次，繼續觀察細胞的形態及生長情況，依次傳代記為P1，P2，P3等。

形態學觀察鑒定：每日應用倒置相差顯微鏡，觀察細胞的生長情況，觀察其大體形態。

倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養24小時后可見部分細胞開始貼壁，少量細胞呈現短梭形改變；4～6天可見細胞集落形成，增值速度明顯加快，7天左右細胞排列密集，呈旋渦狀生長。傳代后4～8小時大部分細胞貼壁，增殖迅速；第二代以后的細胞形態較均一，呈放射狀漩渦樣排列；第三代細胞生長狀態良好。此時可進行傳代培養，傳代后，細胞增值速度加快，傳至P3代，絕大多數細胞形態趨于穩定，呈梭形、放射狀向周邊生長，細胞體積較之前增大。

細胞表型鑒定：將生長狀態良好的第三代BMSCs消化，以每管5×105個細胞收集于流式管中，熒光標記抗體PE-cy5-CD45(1∶500)和PE-CD90(1∶500)，避光孵育30分鐘，PBS洗滌3次后上機檢驗。結果顯示，細胞表達CD90，陽性率為94.05％；而CD45呈陰性表達，表達率為2.19％。

生長曲線：經培養至第三代的細胞1d內處于潛伏期，生長緩慢，2～4天處于對數生長期，5～7天進入平臺期，細胞基本鋪滿瓶底，生長緩慢。