[發明專利]浮萍原生質體制備方法

有效

• 申請號: 201610908853.4
• 申請日: 2016-10-19
• 公開（公告）號: CN107964530B
• 公開（公告）日: 2019-08-27
• 發明（設計）人: 楊琳;韓玉潔;吳迪;王蘇桐;魏瑩;李紅雅;張小蘭;劉文鑫;陸美伊;王家樂
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 天津創智天誠知識產權代理事務所(普通合伙) 12214
• 代理人: 李蕊;王秀奎

1.一種浮萍原生質體制備方法，其特征在于，按照下述步驟進行：

步驟1，調整Datko培養基的PH至5～6，于95～105kPa、120～125℃下進行高壓滅菌；所述Datko培養基由水和下述濃度的化合物組成：

步驟2，采集浮萍，將浮萍培養于步驟1所述的Datko培養基上，每周繼代1～2次，得到浮萍植株；其中，培養條件為：溫度18～25℃，光周期16～18小時/天，光強95～97μmol m^-2s^-1；

步驟3，夾取步驟2中所述浮萍植株，用A液清洗后，將所述浮萍植株放入離心管中，加入組織固定液固定所述浮萍植株至少15min；其中，所述組織固定液由去離子水和下述濃度的乙醇水溶液和冰醋酸組成：

乙醇水溶液 85～95g/l

冰醋酸 95～100g/l，

其中，在所述乙醇水溶液中乙醇的體積濃度為80～90％；

所述A液由去離子水和下述濃度的化合物組成：

Nacl 8～9g/l

K₂HPO₄·3H₂O 11～12g/l

KH₂PO₄ 6～7g/l

步驟4，在酶解溫度為23～27℃的條件下，用組織酶解液在黑暗條件下酶解步驟3所得的浮萍植株25～30min，每間隔10～15min吹打混勻一次，得到懸浮的浮萍原生質體；其中，所述組織酶解液由去離子水和下述濃度的物質組成：

2.根據權利要求1所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，在所述步驟1中，高壓滅菌至少20分鐘。

3.根據權利要求1所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，在所述步驟1之前，制備Datko培養基母液，通過對所述Datko培養基母液進行稀釋得到所述Datko培養基。

4.根據權利要求3所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，將所述Datko培養基母液與水按照體積比為(2～3)：1000的比例進行混合，得到所述Datko培養基。

5.根據權利要求1所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，在所述步驟3中，所述A液的PH為7～8。

6.根據權利要求1所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，在所述步驟4之后，對所述浮萍原生質體清洗2～3次。

7.根據權利要求6所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，通過離心對所述浮萍原生質體進行清洗：用20～25℃的B液垂直打入浮萍原生質體所在離心管，以使所述浮萍原生質體懸浮，進行離心，離心后移除上層清液；所述B液由去離子水和下述濃度的化合物組成：

8.根據權利要求7所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，所述B液的PH為7～8。

9.根據權利要求7所述的浮萍原生質體制備方法，其特征在于，相對離心力為2000～2500×g；每次清洗3～4min。