[發明專利]一種美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光RT-RPA特異性檢測

有效

• 申請號: 201610905093.1
• 申請日: 2016-10-18
• 公開（公告）號: CN106636459B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 王建昌;袁萬哲;王金鳳;劉立兵;婁巧哲
• 申請（專利權）人: 河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 石家莊新世紀專利商標事務所有限公司 13100
• 代理人: 張曉龍

本發明涉及一種用于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光RT?RPA特異性檢測的引物和exo探針組合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ ID No.2所示；exo探針序列如SEQ ID No.3所示。本發明還包括利用上述引物及exo探針組合進行熒光RT?RPA特異性檢測的方法，以及包含該引物和exo探針的試劑盒。本發明能夠用于現場檢測，操作簡單、快速、特異性強、靈敏性高。

技術領域

本發明涉及分子生物學和病毒檢測鑒定技術領域，具體涉及一種美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光RT-RPA特異性檢測方法、其相應的引物和探針組合以及包含該引物和探針組合的試劑盒。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)主要引起懷孕母豬的繁殖障礙和所有日齡豬的呼吸道癥狀，被認為是影響世界養殖業最重要的傳染病之一。引起該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)，是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬。PRRSV于1987年首次分離于北美，然后于1990年分離于西歐。目前，PRRSV遍布全球，成為造成經濟損失最嚴重的豬病之一。根據PRRSV基因和抗原差異，目前將之分為兩個基因型，即歐洲型(基因1型)和美洲型(基因2型)。

我國自1986年首次分離到PRRSV以來，目前該病毒已經遍及全國，并且部分地區豬群的感染率達到90％。2006年，以Nsp2基因出現30個不連續氨基酸缺失為特征的高致病性PRRSV在我國的爆發，對我國養豬業造成了巨大的經濟損失。2006年6月到9月，高致病性PRRSV造成約2,120,000頭豬感染，400,000頭豬死亡，而2007年1月到7月，造成約143,221頭豬的感染，39,455頭豬死亡。截至目前，我國豬群主要流行美洲型PRRSV，并且經典毒株(C-PRRSV)和高致病性毒株(HP-PRRSV)同時存在。隨著我國大型養豬場和集約化養殖模式的發展，對豬病的現場、快速診斷將極大有益于豬場疫病控制，尤其是大型養豬場多位于邊遠地區的情況下。

上述事實清晰表明，對PRRSV的快速、現場診斷極大有益于我國豬場中PRRS的防控。傳統的PRRSV檢測技術，主要是病毒分離、免疫組化和免疫熒光技術，費時費力，對檢測人員技術要求較高，靈敏性低，無法滿足目前快速檢測的需要。

目前對PRRSV的實驗室分子診斷技術主要包括RT-PCR、同時檢測美洲型和歐洲型PRRSV、特異性檢測HP-PRRSV和同時檢測C-PRRSV和HP-PRRSV的熒光RT-PCR，以及特異性針對美洲型PRRSV的RT-LAMP方法。但是，PRRSV快速進化和基因變異使得建立長期有效的RT-PCR方法異常復雜，設計保持足夠敏感性的LAMP引物異常困難，從而導致假陰性檢測結果。同時，RT-PCR和RT-LAMP試劑需要冷鏈運輸、價格高昂的設備和經驗豐富的技術人員，從而難以應用于現場檢測。因此，需要建立一種能夠用于PRRSV現場檢測的操作簡單、快速、準確和成本較低的檢測方法。

發明內容

為了解決上述問題，本發明建立了一種能夠用于現場檢測，操作簡單、快速、特異性強、靈敏性高的PRRSV熒光RT-RPA檢測方法、其相應的引物和探針組合以及包含該引物和探針組合的試劑盒。

本發明采用如下技術方案：

一種用于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的熒光RT-RPA特異性檢測的引物和exo探針組合，其關鍵技術在于，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示；反向引物序列如SEQ IDNo.2所示；exo探針序列如SEQ ID No.3所示。

一種美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光RT-RPA特異性檢測的方法，其關鍵技術在于，提取待測樣品的RNA為模板，利用上述的引物及exo探針組合進行擴增及實時熒光檢測。