[發(fā)明專利]核酸分子CTL4HSH14、其制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610904341.0
• 申請(qǐng)日: 2016-10-18
• 公開（公告）號(hào): CN107955813A
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱波;彭景濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 上海元一成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種核酸分子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。我國(guó)的腫瘤病例數(shù)相當(dāng)龐大，有資料顯示占全世界病例數(shù)的55%。腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號(hào)"殺手"，其死亡人數(shù)僅次于心血管病。

良性腫瘤對(duì)機(jī)體的影響較小，主要表現(xiàn)為局部壓迫和阻塞癥狀。惡性腫瘤由于分化不成熟、生長(zhǎng)較快，浸潤(rùn)破壞器官的結(jié)構(gòu)和功能，并可發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而對(duì)機(jī)體影響嚴(yán)重。惡性腫瘤除可引起與上述良性腫瘤相似的局部壓迫和阻塞癥狀外，還可有發(fā)熱、頑固性疼痛，晚期可出現(xiàn)嚴(yán)重消瘦、乏力、貧血和全身衰竭的狀態(tài)。

近幾年來(lái)，國(guó)外醫(yī)學(xué)界對(duì)于腫瘤疾病的發(fā)病機(jī)理在細(xì)胞基礎(chǔ)上又有了新的認(rèn)識(shí)。 基于對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步理解，人們利用各種途徑來(lái)研制和開發(fā)能夠特異，有效地殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性的藥物。 目前，對(duì)于癌癥的治療仍以化療及放療為首選，兩者雖對(duì)腫瘤的治療取得了相當(dāng)?shù)寞熜В捎谌狈?duì)腫瘤細(xì)胞的特異性因而具有較大的毒副作用以及某些腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了它們?cè)谂R床中的應(yīng)用。 近年來(lái)，為了開發(fā)出能特異性地殺傷癌細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒負(fù)作用的藥物，人們對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞,分子水平上的研究予以高度重視和巨額投資。例如，“結(jié)直腸癌”（CRC）在腫瘤中向來(lái)有“富貴病”之稱,表明其與人們的生活習(xí)慣有著密切的聯(lián)系。在上海,隨著生活水平的提高,結(jié)直腸癌的發(fā)病率已躍居常見(jiàn)惡性腫瘤的第二位,僅次于肺癌。據(jù)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院資料統(tǒng)計(jì),近幾年結(jié)直腸癌手術(shù)量連年攀升,2007年該院結(jié)直腸癌手術(shù)量近900例,2008年已突破千例,達(dá)到了1027例。研制能特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用的藥物或者化合物一直是本領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于抑制體外細(xì)胞CTL4基因表達(dá)的核酸分子。通過(guò)制備、應(yīng)用該核酸分子抑制體外CTL4基因的表達(dá)，從而達(dá)到維持目標(biāo)細(xì)胞正常生理狀態(tài)的效果。

本發(fā)明提供了一種新的核酸分子，它具有抑制體外細(xì)胞CTL4基因表達(dá)的活性；

并且

其抑制的目標(biāo)元件包括SEQ ID NO 1 所示的序列。

更好的，目標(biāo)元件具有SEQ ID NO 1 所示的序列。

本發(fā)明還提供了一種重組載體，它包含上述核酸分子。

其中，A、T、G和C分別是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“CTL4HSH14”指具有抑制血管CTL4表達(dá)活性、并且抑制的目標(biāo)元件包括SEQ ID NO 1 所示序列的核酸分子。該術(shù)語(yǔ)還包括目標(biāo)元件的序列與SEQ ID NO 1的同源性至少90%的核酸分子。

該術(shù)語(yǔ)還包括在目標(biāo)元件5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為5個(gè)以內(nèi)，較佳地為3個(gè)以內(nèi))核苷酸，或者3‘端加入若干dT（脫氧胸苷）后形成的序列。

在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將含有本發(fā)明CTL4HSH14所對(duì)應(yīng)的DNA序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成重組載體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林腦炎病毒表達(dá)系統(tǒng)(Semliki Forest Virus)。慢病毒（Lentivirus）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬,以人類免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus, HIV)為代表。慢病毒不僅具有感染分裂靶細(xì)胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞和干細(xì)胞等在內(nèi)的多種非分裂細(xì)胞能力，因而，慢病毒載體已作為基因轉(zhuǎn)移的有效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤其是基因治療的研究。

另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制體外細(xì)胞CTL4基因表達(dá)的試劑盒，它包括上述核酸分子。

較好的，所述的核酸分子的序列如SEQ ID NO 2或者SEQ ID NO 3所示。

例如，它具有序列如SEQ ID NO 2所示的核酸分子。

或者，它具有序列如SEQ ID NO 3所示的核酸分子。

更好的，它具有序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示的核酸分子。