[發明專利]一種甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC檢測方法

有效

• 申請號: 201610896901.2
• 申請日: 2016-10-14
• 公開（公告）號: CN106526037B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 王澤平;李毅杰;劉璐;蔣洪濤;李長寧;張保青;高軼靜;羅霆;張革民;韋金菊;段維興;周珊;楊翠芳;林善海
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所（中國農業科學院甘蔗研究中心）
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88;G01N30/89
• 代理公司: 南寧東智知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 45117
• 代理人: 戴燕桃;韓暢

本發明公開了一種甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC檢測方法，包括以下步驟：S1.將待測的甘蔗葉片加入液氮磨碎，甲醇浸提，離心，取上清液，殘渣用甲醇浸提，離心后取出上清液，合并上清液，減壓蒸發，萃取脫色，下層水相減壓蒸干，加入流動相溶解，定容，過濾，作為樣品溶液備用；S2.采用HPLC檢測樣品溶液中水楊酸的含量。本方法能準確檢測出甘蔗葉片中水楊酸含量，為判斷甘蔗品種對梢腐病感抗差異研究和水楊酸介導甘蔗梢腐病病原菌脅迫應答生化機制提供科學有力的檢測技術。

技術領域

本發明涉及甘蔗內源激素檢測技術領域，特別是一種甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC 檢測方法。

背景技術

甘蔗（Saccharum officinarum)是我國最重要糖料作物，蔗糖占我國食糖總產92%。甘蔗中含有的植物激素幾乎參與了其生長發育所有過程的生理調節，從細胞的生長分裂和分化，到種子的休眠、果實發育、性別分化和衰老過程等。對于甘蔗而言，它有2個非常重要的指標直接影響著甘蔗的經濟價值，分別糖分和產量，但如果甘蔗受到病蟲害影響而不能及時發現，則會大大影響甘蔗的糖分和產量。如果能夠通過研究甘蔗生長過程中內源激素的變化趨勢，判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異，并建立對應病原菌脅迫應答的生化機制，那么將對甘蔗經濟價值的增長具有重大的現實意義。

目前，我國甘蔗梢腐病的發生有逐漸加重的趨勢，由于梢腐病逐漸表現出無區域性和無規律性等特點，導致該病對甘蔗產業的危害日趨嚴重。在巴西、印度、伊朗、馬來西亞以及我國等蔗區各類梢腐病癥狀層出不窮，尤其在高溫高濕季節容易暴發此病。據2012-2014年廣西甘蔗品種區域試驗以及2013-2014年國家甘蔗品種區域試驗調查，參試品種發病率達到100%。此病害可導致甘蔗株高顯著降低，產量減少5%～20%，糖分降低達3%。甘蔗在受到梢腐病病原侵染時，會產生一系列的防御反應來保護自己，與此同時，病原真菌也會通過改變自身毒性或產生變異，由此影響甘蔗正常生理生化進程，從而感染甘蔗并導致發病。因此，對感染梢腐病病原后的內源激素變化趨勢研究是十分緊迫的問題。

水楊酸作為一種重要的植物內源激素，其參與甘蔗生理代謝過程一個突出特點是促使蔗莖的伸長和蔗株增高。而甘蔗是以蔗莖作為收獲產品的作物，因此在生產中增加蔗株高度對于提高甘蔗產量是相當重要的。但至今尚無建立高效、精確的葉片水楊酸含量檢測方法，鑒于此建立一套快速有效的甘蔗葉片水楊酸含量檢測方法，對及時判斷甘蔗品種感染病原后的感抗差異和研究水楊酸內源激素介導甘蔗梢腐病病原菌脅迫應答的生化機制具有非常重要的意義。

發明內容

針對我國甘蔗葉片水楊酸含量檢測方法的空白，本發明的目的在于提供一種簡便、快速、準確的甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC 檢測方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方法如下：

一種甘蔗葉片中水楊酸含量的HPLC 檢測方法，包括以下步驟：

S1.將待測的甘蔗葉片加入液氮磨碎，加入預冷至2~5℃的體積分數為70~90%甲醇水溶液，2~5℃浸提10~20h，離心，取上清液，殘渣再加入預冷至2~5℃的體積分數為70~90%甲醇水溶液在2~5℃下浸提1~3h，離心后取出上清液，重復殘渣浸提和離心操作0~3次，合并上清液，30~40℃下減壓蒸發至不含甲醇，加入石油醚萃取脫色2~5次，棄去上層有機相，下層水相在30~40℃下減壓蒸干，加入HPLC檢測所用流動相溶解，定容，過濾，作為樣品溶液備用；

S2.采用HPLC檢測樣品溶液中水楊酸的含量。

進一步的，所述步驟S2中，HPLC色譜條件為：流動相是甲醇和乙酸按體積比1:99混合制成，柱溫為32~38℃，流速0.8~1.2ml/min，紫外檢測波長 306nm。

進一步的，所述步驟S6中，HPLC色譜條件為：柱溫為35℃，流速1ml/min，進樣量 10μL。