[發明專利]一種用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體及其應用

有效

• 申請號: 201610894671.6
• 申請日: 2016-10-13
• 公開（公告）號: CN106645050B
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發明（設計）人: 許丹科;李慧;陳竹;劉曉輝
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 丁靜靜;肖明芳

本發明公開了一種用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體，所述適配體的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～65所示。本發明還公開了利用上述適配體檢測乳鐵蛋白的方法，該方法以熒光標記的適配體作為探針分子，通過適配體與乳鐵蛋白的特異性結合使熒光偏振信號發生變化。熒光偏振信號與乳鐵蛋白濃度之間存在線性關系從而實現對乳鐵蛋白的定量檢測。此方法靈敏度高，特異性好，檢測的線性范圍為0.78～50μg/mL。該方法能實現對復雜樣品中目標物的測量，如牛奶中乳鐵蛋白的測量。此外，該方法使用BioTeK酶標儀對96孔板直接掃描，達到了快速、高通量測量的要求，可以同時對多個樣品進行有效測量。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種使用熒光偏振法對乳鐵蛋白進行檢測的適配體及其應用。

背景技術

熒光偏振技術作為一種簡單可靠的信號傳導手段，可以基于熒光基團的分子質量的變化提供關于分子取向、遷移和作用過程的信息。熒光偏振分析法具有很多的優勢：第一，它是一種均相分析方法且靈敏度高，無需分離等復雜操作，結果重現性好；第二，響應時間快，可以實時監測分子間相互作用；第三，可以與酶標儀等儀器聯用，可以實現自動化高通量測定；第四，熒光偏振依賴于兩個垂直方向上的熒光強度的比值，與熒光絕對強度無關，熒光偏振值對熒光的波動及光漂白不敏感，從而成為在復雜生物樣品中均相測定目標分子的理想分析方法。因此，熒光偏振技術在熒光傳感應用中受到廣泛的研究關注。

乳鐵蛋白是一種極具廣闊市場前景的功能性蛋白，它主要存在于哺乳動物的乳汁中，其含量與動物的種屬息息相關，以人乳、牛乳為典型代表。研究表明，乳鐵蛋白具有多種生物學活性。它具有參與鐵代謝、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、阻斷氧自由基、免疫調節及抗炎癥、促進細胞增長、減少內臟脂肪等多種功能。且由于乳鐵蛋白是一種可被嬰兒攝入的、安全極高的天然乳成分，其在日本被批準為食品添加劑，在美國被納入一般認為安全物質之中。加之，乳鐵蛋白廣泛的生物學功能深受國內外食品相關企業的高度重視，在我國GB 14880—2012《食品營養強化劑使用標準》中，乳鐵蛋白也被列為一種新型營養強化劑并規定了其在相關乳制品中的含量標準。因而，能否建立快速準確的乳鐵蛋白檢測技術對于食品安全來說至關重要。目前，適合不同類型生物樣品中乳鐵蛋白的檢測技術主要有分光光度法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附法、高效親和色譜法、高效毛細血管電泳法以及表面等離子共振技術等檢測技術，但這些方法依然存在前處理過程復雜、實際樣品回收率低、穩定性差等特點，因此建立出一種能夠全面實現準確、快速、無需對樣品進行前處理的全自動乳鐵蛋白檢測方法十分重要且緊迫。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體。

本發明還要解決的技術問題是提供上述適配體在檢測乳鐵蛋白中的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體，所述適配體的核苷酸序列如SEQ ID NO.5~65所示，所述的適配體優選SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.35。

上述用于檢測乳鐵蛋白含量的適配體在檢測乳鐵蛋白中的應用。

一種熒光偏振法測量陰性蛋白含量的方法，包括如下步驟：

(1) 繪制標準曲線：向10 μL、40 nM~4000 nM異硫氰酸熒光素標記的適配體溶液中加入100 μL不同濃度的陰性蛋白標準樣品，混勻，所述適配體的核苷酸序列為SEQ IDNO.1~61中的任一種，25℃~40℃下反應5～120min，用酶標儀檢測，激發波長為480nm，發射波長為528nm，繪制標準曲線；

(2) 樣品檢測：將異硫氰酸熒光素標記的適配體與待測樣品混合，按照步驟(1)的條件檢測。

其中，所述異硫氰酸熒光素標記的適配體的濃度為40 nM~4000 nM；