[發明專利]一種芳氧苯氧丙酸類除草劑水解酯酶及其應用

在審

• 申請號: 201610891483.8
• 申請日: 2016-10-12
• 公開（公告）號: CN107012132A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 董維亮;張越;馬江鋒;章文明;信豐學;姜岷
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N9/20;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12N1/20;B09C1/10;A62D3/02;C12R1/19;C12R1/01;A62D101/04
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所32230
• 代理人: 徐蓓,尹妍

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種芳氧苯氧丙酸類除草劑水解酯酶及應用。

背景技術

芳氧苯氧丙酸類除草劑(AOPP)主要用于防除禾本科雜草，因其高效、低毒而在我國及世界作物田廣泛應用。當前國際市場上銷量最大的AOPP除草劑品種是炔草酯和精惡唑禾草靈，2003年和2009年該除草劑的銷售額分別為2.5億美元和2.8億美元，占該類除草劑總銷售量的31.2％，位于全球除草劑銷量榜第七位。盡管除草劑的毒性相對較低，但大量研究表明AOPP對水生生物表現為高毒性，過渡殘留會給水體生物和人類健康帶來了巨大的威脅。

環境污染物在環境中的降解主要分為光解、水解和生物降解。AOPP的降解主要依賴于土壤中微生物的作用，而微生物對物質的降解主要由細胞內的酶來完成。微生物是各種酶制劑的重要來源，利用分子克隆技術從產酶微生物中克隆產酶基因，再將其與合適的載體連接并轉入相應宿主細胞，可進行酶的大量表達便于應用。目前，通過基因工程技術手段進行生產酶，已經成為工業用酶的主導。

酯酶廣義上是指具有催化水解酯鍵能力的一類水解酶的總稱，而通常所說的酯酶往往是羧酸酯酶，主要用來水解脂肪酸族和芳香族酯類物質。三酰甘油酯類以及對硝基苯酯類物質都是酯酶的特異性底物。由于酯酶具有很高的活性，作為生物催化劑，利用其水解反應、酯轉化和酯合成反應可以廣泛應用于醫藥、化工、食品、能源及環保領域。

發明內容

本發明的目的是針對芳氧苯氧丙酸類除草劑對水生生物會產生高毒性的問題，提供一種AOPP水解酯酶。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種芳氧苯氧丙酸類除草劑水解酯酶AopH，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明還提供了編碼該水解酯酶的基因aopH，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。該基因全長(從起始密碼子到終止密碼子)為927bp，G+C含量為45.88％。本發明以AOPP除草劑炔草酯為唯一碳源從土壤中分離篩選到一株高效降解炔草酯的菌株Acinetobactersp.VL-2，所述菌株VL-2為本實驗室自主篩選，已于2016年7月4日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為：CCTCC NO：M2016374。本發明以該菌株VL-2為材料構建其基因組文庫，并成功從該文庫中克隆出所述水解酯酶基因aopH。

本發明的另一目的是提供含有上述編碼基因aopH的表達載體及基因工程菌。

所述表達載體的出發載體選用pET-28a(+)，構建含aopH的重組質粒pET-aopH作為表達載體。

選用宿主菌E.coli BL21(DE3)構建含有AOPP水解酯酶基因aopH的基因工程菌E.coli BL21(DE3-pET-aopH)，高效表達酯酶基因。

所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3-pET-aopH)的構建方法：所述的含AOPP水解酯酶基因的pET-28a(+)重組質粒轉化到表達宿主菌E.coli BL21(DE3)獲得重組微生物E.coli BL21(DE3-pET-aopH)，再將所獲得的重組微生物轉接到含有100mg/L炔草酯(AOPP)、50mg/L卡那霉素和24mg/L IPTG的平板，37℃培養16h后，挑取有透明水解圈的陽性轉化子，經測序驗證基因序列無誤后，保存。

本發明的又一目的是提供該基因酶的應用。利用該基因生產的酶制劑可用于環境的生物修復、食品加工、醫藥、洗滌等行業，不僅可以解決AOPP的環境污染問題，還可以取得可觀的經濟效益。

其中，所述的AOPP包括精惡唑禾草靈、精喹禾靈、炔草酯、氰氟草酯、氟吡甲禾靈。

所述的AOPP水解酯酶AopH在水解三酰甘油酯中的應用，所述的三酰甘油酯優選三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯、三辛酸甘油酯或、三癸酸甘油酯。

所述AOPP水解酯酶AopH在水解對硝基苯酯中的應用，所述的對硝基苯酯優選乙酸對硝基苯酯、丁酸對硝基苯酯、己酸對硝基苯酯、辛酸對硝基苯酯、癸酸對硝基苯酯、月桂酸對硝基苯酯、肉豆蔻酸對硝基苯酯、棕櫚酸對硝基苯酯，進一步優選乙酸對硝基苯酯。

所述的AOPP水解酯酶AopH在水解三酰甘油酯中的應用，所述的三酰甘油酯優選三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯或三己酸甘油酯。