[發明專利]一種妊娠期酒精暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法

有效

• 申請號: 201610891029.2
• 申請日: 2016-10-13
• 公開（公告）號: CN107937339B
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 秦建華;朱玉娟;于躍;尹方超
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 鄭虹

一種妊娠期酒精暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，該方法主要結合了新興的hiPSCs來源的3D腦組織和生物材料海藻酸鈉絲，通過加以適度的酒精刺激，模擬妊娠期酗酒對胎兒早期腦發育的影響。該模型作為創新的體外器官發育疾病模型，不僅利于直觀觀察酒精對腦發育的形態學影響，也可以借鑒各種檢測方法，研究酒精對腦發育影響的分子學和細胞學機制，彌補了傳統細胞實驗和動物實驗的不足，為研究妊娠期酒精對胎兒早期腦發育的影響提供了有力的工具。

技術領域

本發明微流控芯片技術，具體涉及一種妊娠期酒精暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法。

背景技術

研究病理條件的分子學和細胞學機制研究為我們更好地了解、控制和治療疾病提供了基礎。傳統的生物方法主要包括2D的細胞培養方式和動物模型。2D的細胞培養無法模擬生理條件下細胞的微環境，包括三維細胞外基質、間隙流、細胞間相互作用等，因此與生理條件下相比細胞的形態功能有很大不足，不能完全反映病理條件下分子層面和細胞層面的異常變化。而動物實驗目前主要是使用鼠、兔、果蠅、線蟲等模式生物，雖然模式生物來源方便、培養條件簡單，但是基于人與動物的極大不同，因此很難完全反映各種條件下人體的生理變化。而對于人體的研究在保證最低損傷和方便觀察的前提下，較為常用的有核磁共振、CT等，但是這些方法不具實時監測特點，并且很多都無法應用于胎兒發育、

近幾年來各種干細胞來源的類器官發育得到了有效發展，包括神經干細胞、腸干細胞、胚胎干細胞以及iPSCs。類器官的特征是干細胞或原代細胞自發形成的3D細胞團結構，其含有相應組織器官的多種功能細胞，這些細胞自組裝成具有一定結構功能特異性的組織，一定程度上模擬了相應組織器官的發育過程。其中體外hiPSCs來源的3D腦基本復制了胎兒早期腦發育的過程。

但是目前來看類器官技術也有許多不足和需要改進的地方。由于其3D細胞團的結構特點，使得內部細胞由于缺少氧氣和營養，出現大規模死亡，極大限制了體外類器官發育的程度，包括體積大小、功能成熟度等，而在生理情況下組織和器官中分散著血管組織來提供所需的氧氣和營養。因此結合其他技術有望彌補這種不足。此外，現有的傳統細胞培養技術培養類器官操作復雜、耗費時間長、可控性差。因此與現有的生物工程類手段結合有望優化類器官技術。

絲狀結構作為培養載體，有幾大優勢：首先，借助微流控芯片技術可根據實際應用靈活高效產生不同尺寸、厚度的海藻酸鈉絲。其次，絲狀結構具有較高的比表面積比，利于物質交換，對于細胞培養提供良好的生存環境。再次，絲狀結構可導向細胞團的生長，產生結構類似的腦組織，并在發育過程中限制其生長，一定程度上模擬了生理情況下腦膜的作用。最后，海藻酸鈉材料可在高鹽或檸檬酸鈉條件下溶解，釋放細胞，滿足不同的處理需求。

但是目前將生物工程與hiPSCs來源的類器官相結合，建立人屬的疾病模型領域尚屬空白。

發明內容

本發明的目的是提供一種妊娠期酒精暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，該方法使用海藻酸鈉中空絲作為細胞培養載體，不僅保證了發育過程中的物質運輸，同時實現可控的發育結構，并具實時監測的特點。

本發明提供了一種妊娠期酒精暴露對胎兒腦損傷的體外模型建立方法，其步驟主要分為四部分：

(1)海藻酸鈉中空絲的制備；

(2)3D腦前期誘導；

(3)3D腦包裹在海藻酸鈉中空絲內；

(4)酒精處理3D腦。

步驟(1)海藻酸鈉中空絲的制備，具體為：

所述海藻酸鈉中空絲的制備是利用套管形式的微流控芯片，制備的中空絲內徑為600-1000μm，管壁厚度為50-200μm，所用液體無菌處理。

所述海藻酸鈉絲需浸泡在DMEM/F12培養基中，使其完成在培養基中的溶脹過程，并在4℃低溫保存，便于后續操作。