[發明專利]一種煙草KC1基因及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610880290.2
• 申請日: 2016-10-09
• 公開（公告）號: CN107012152A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 任學良;魯黎明;李立芹;郭玉雙;張潔
• 申請（專利權）人: 貴州省煙草科學研究院
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務所11569
• 代理人: 李娜

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種煙草KC1基因及其制備方法。

背景技術

鉀離子通道是允許鉀離子特異通透質膜的離子通道，而阻礙其他離子通透-特別是鈉離子。這些通道一般由兩部分組成：一部分是通道區，選擇并允許鉀離子通過，而阻礙鈉離子；另一部分是門控開關，根據環境中的信號而開關通道。

AtKC1是目前發現的唯一不能在異源表達系統中產生電流的Shaker家族α亞基。它被公認為是一個調控其它Shaker家族成員的蛋白。通過酵母雙雜交實驗證明AtKC1胞內區能與AKT1和AKT2互作(Pilot et al.,2003)。通過煙草葉肉原生質體中的電生理實驗證明AtKC1對AKT1產生負調控作用(Duby et al.,2008)。在胡蘿卜中有一個與AtKC1同源性很高的KDC1基因，KDC1能在CHO細胞中單獨形成有功能的內向鉀通道(Downey et al.,2000)。

煙草是一種耗鉀量很大的作物，煙葉鉀含量是衡量煙葉品質的的重要指標，目前，對于煙草中鉀離子通道的研究較少，煙草KC1的功能未知。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供煙草KC1基因及其制備方法和應用。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種煙草KC1基因，所述KC1基因的序列如Seq ID No.1所示。

本發明提供了上述技術方案所述KC1基因的制備方法，包括以下步驟：設計PCR擴增引物，所述的PCR擴增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列為：5’-ATGTCATACTCGGACACG-3’，所述的反向引物的核苷酸序列為5’-TCAAAAAATATACAAGTGATC-3’；提取煙草細胞總RNA；合成煙草細胞的cDNA；以所述煙草細胞cDNA為模板進行KC1基因的PCR擴增，得到目的片段，測序后得到KC1基因序列。

優選的，所述PCR擴增引物的設計是以GenBank:AB196791.1為參考序列，使用軟件primer 5設計得到的，所述AB196791.1的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

優選的，所述的PCR擴增的體系為20μL體系，包括Premix ExTaq 10μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，煙草細胞cDNA 1μL，ddH₂O 8μL。

優選的，所述的PCR擴增的反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸2min；35個循環。

優選的，所述的目的片段在測序之前還包括，將所述目的片段導入大腸桿菌DH5α感受態細胞中進行菌落PCR驗證，驗證為陽性克隆后進行測序。優選的，所述菌落PCR驗證使用的正向引物的核苷酸序列為：5’-ATGTCATACTCGGACACG-3’，所述菌落PCR驗證使用的反向引物的核苷酸序列為：5’-TCAAAAAATATACAAGTGATC-3’。

優選的，所述菌落PCR驗證的體系為10μL，包括Premix ExTaq 5μL，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，ddH₂O 4μL。

本發明還提供了一種煙草KC1基因在促進煙草植株鉀離子吸收和轉運方面的應用。

優選的，將所述的煙草KC1基因轉入到煙草植株中，使KC1基因超量表達以提高煙草植株的煙葉中鉀離子的含量。

本發明的有益效果：本發明提供的KC1基因，是通過同源克隆克隆的方法制備獲得的，所述的KC1基因全長1923bp，經功能驗證，本發明提供的KC1基因轉入鉀吸收缺陷型酵母突變株R5421后的重組酵母具有鉀離子吸收，轉運功能。本發明實施例中，3個KC1基因轉基因煙草葉中鉀離子的質量含量分別是2％，1.8％，1.6％，非轉基因的煙草葉中鉀離子的質量含量是0.84％，轉基因的煙草葉中鉀離子的含量顯著高于非轉基因的，可見，煙草植株中超量表達KC1基因可促進煙草對鉀離子的吸收。因此，本發明提供的KC1基因具有促進鉀離子吸收和轉運的功能。

附圖說明