[發(fā)明專利]一種酯酶EstK1蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610878042.4
• 申請(qǐng)日: 2016-10-08
• 公開（公告）號(hào): CN106834250B
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛相朝;董浩;孫建安;薛長(zhǎng)湖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/18
• 分類號(hào): C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32231
• 代理人: 袁媛

本發(fā)明提供一種酯酶EstK1蛋白及其應(yīng)用，其公開了新型酯酶EstK1的氨基酸序列和核苷酸序列，由于該酶在疏水性有機(jī)溶劑中具有良好的耐受性及高轉(zhuǎn)酯活性，EstK1被用來(lái)制備乙酯類香料；由于EstK1具有高效催化制備乙酸肉桂酯的能力，可在2h內(nèi)將大部分肉桂醇轉(zhuǎn)化為乙酸肉桂酯，乙酸肉桂酯的回收率達(dá)到97.1％。且本發(fā)明底物譜的研究顯示EstK1可用于制備正辛醇乙酯、2?苯乙醇乙酯，香茅醇乙酯和香葉醇乙酯等，暗示了酯酶EstK1具有制備乙酯類香料的潛能。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于功能酶篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酯酶EstK1蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

酯酶(Esterase；EC 3.1.1.1)屬于脂解酶的一種，可催化酯鍵的水解和合成，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。脂肪酶和酯酶同屬于脂解酶類，它們催化酯鍵合成和水解的機(jī)理相同，不同點(diǎn)在于脂肪酶催化水解合成水不溶性的長(zhǎng)鏈甘油酯(碳鏈長(zhǎng)≥10)，酯酶催化水解合成水溶性的短鏈甘油酯(碳鏈長(zhǎng)10)。在水相中，酯酶催化水解反應(yīng)，在有機(jī)相中，可催化酯合、轉(zhuǎn)酯、酯交換和氨解等反應(yīng)的進(jìn)行。因其良好的底物特異性、立體選擇性和區(qū)域選擇性，酯酶成為一種重要的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑和化工等行業(yè)。然而，不同于脂肪酶，目前只有極少數(shù)的酯酶應(yīng)用于有機(jī)合成中。因此，開發(fā)新型且具有優(yōu)良性狀的酯酶，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

乙酸酯是一種非常重要的酯類，常作為調(diào)味劑或香料廣泛應(yīng)用在食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)。其中，乙酸肉桂酯屬于苯丙素類物質(zhì)，自然條件下存在于新鮮桂皮中。研究表明，乙酸桂酯具有良好的生物活性，特別是抗氧化性，這可能歸因于乙酸桂酯的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。乙酸桂酯已經(jīng)被用來(lái)合成HIV-蛋白酶抑制劑。再者，乙酸桂酯因其良好的甜、香、花香氣味，廣泛應(yīng)用在香料行業(yè)。天然乙酸肉桂酯可以從植物中提取，但是低的提取率導(dǎo)致生產(chǎn)成本的大大提高；化學(xué)合成法是一個(gè)高效制備乙酸肉桂酯的方法，但是有毒化學(xué)品的使用降低了產(chǎn)品的安全性，并且化學(xué)法的低專一性，使得反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物。酶催化的方法被認(rèn)為是一個(gè)理想的替代法，因其溫和的反應(yīng)條件和環(huán)境友好型的進(jìn)程，使得酶催化法越來(lái)越受到關(guān)注。然而，目前酶催化制備乙酸肉桂酯主要采用脂肪酶催化法，都存在轉(zhuǎn)化率低和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，這可能與脂肪酶偏好長(zhǎng)鏈脂肪酸的特點(diǎn)有關(guān)。酯酶偏好短鏈脂肪酸，因此使用酯酶催化制備乙酸桂酯，被認(rèn)為是一個(gè)良好的選擇。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種酯酶EstK1蛋白及其應(yīng)用，利用該酯酶的轉(zhuǎn)酯活性于非水相中，高效催化乙酸肉桂酯等乙酸酯的合成，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的酯酶EstK1蛋白，其氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

本發(fā)明提供一種編碼酯酶EstK1蛋白的estK1基因，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

本發(fā)明提供一種攜帶estK1基因的載體，其包括pET21a(+)、pET28a(+)和pET32a(+)。

本發(fā)明提供一種攜帶上述載體的重組表達(dá)載體，其為大腸桿菌BL21(DE3)。

本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，其利用所述酯酶EstK1蛋白非水相生產(chǎn)乙酸肉桂酯。

進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)使用EstK1凍干全細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)。

進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的酰基供體為乙酸乙烯酯。

進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的有機(jī)溶劑為異辛烷。

進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的底物肉桂醇和乙酸乙烯酯的摩爾比為1:4。

進(jìn)一步的，所述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的反應(yīng)溫度為40℃。

效果較好的，本發(fā)明利用所述酯酶EstK1蛋白非水相生產(chǎn)正辛醇乙酯、2-苯乙醇乙酯、香茅醇乙酯或香葉醇乙酯。

有益效果：