[發明專利]一種基于Cpf1的DNA體外拼接方法

有效

• 申請號: 201610877438.7
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN107881184B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 王金;雷超;趙國屏
• 申請（專利權）人: 中國科學院分子植物科學卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/10;C12P19/34
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;馬莉華

本發明涉及一種基于Cpf1的DNA體外拼接方法。所述方法通過設計并合成能夠被CRISPR?Cpf1識別的特異crRNA序列來引導Cpf1特異地將雙鏈DNA的特定位置切開并生成預設的粘性末端。利用本發明的方法,可方便、快捷、準確地獲得預定的粘性末端，對DNA進行拼接。使用本發明的方法能夠對DNA進行工程化、標準化、模塊化的改造或組裝。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，本發明涉及一種基于Cpf1的DNA體外拼接方法。本發明方法可以產生預定粘端，并可用于體外DNA無縫拼接。

背景技術

2010年，J.Craig Venter實驗室完成了蕈狀支原體“Synthia”的人工構建，掀起了一場合成生物學研究風暴。相對于傳統的限制性內切酶酶切-連接酶連接克隆方法，無縫拼接因其不引入額外序列，具有設計方便，兼容性好等多個優點，在合成生物發展過程發揮越來越重要的作用。

目前已有的無縫拼接技術主要包括基于Type IIS限制性內切酶的拼接方法、基于特定堿基修飾的拼接方法和基于同源序列的拼接方法，這些方法的存在極大的方便了DNA的拼接組裝，但同時它們都有各自的局限，有待于進一步的改進。Golden Gate利用TypeIIS限制性內切酶切割位點位于識別位點的外部的特點，通過人為設計不同的粘端實現無縫的體外拼接，對于短片段的體外拼接，尤其是短的重復序列拼接非常有效，但在大片段的拼接過程中由于片段內部的酶切位點的限制而使其應用受到限制。USER fusion克隆方法和MASTER(Methylation-assisted tailorable ends rational)Ligation克隆方法很好的避開了Golden Gate的這一限制，但這兩種方法在使用過程中因為要合成是含有尿嘧啶或者含有甲基化的引物，因此成本較高。SLIC(Sequence and Ligation-IndependentCloning)是一個方便高效的體外拼接方法，因為其僅通過片段兩端的同源序列，通過3'-5'外切酶的消化或者特定的化學修飾而形成同源的粘端，不涉及酶切連接過程，因此在設計的時候非常方便，但SLIC克隆在拼接5個以上的片段以及10kb以上片段時要求同源片段長度較長(大于40bp)，而且效率會急劇下降。Gibson Assembly拼接方法在SLIC的基礎上進行改造，在體系中引入5'-3'聚合酶以及連接酶，因此拼接的效率提高了很多，可以拼接達100Kb以上的片段。基于酵母重組的酵母體內拼接可以進一步提高拼接片段大小的上限，但與SLIC、Gibson拼接一樣，它們都是基于同源序列的拼接，對于存在重復序列的片段拼接無能為力。

CRISPR系統是原核生物中與其獲得性免疫相關的防御系統，因其可以被改造為基因組編輯以及相關應用而被人們廣泛關注[1-3]。Cpf1是typeⅤ類的一員，其在對應的crRNA介導下切割雙鏈DNA，在雙鏈DNA的18位和23位切割DNA，形成5'端突出的粘端[4]。

綜上所述，本領域需要提供一種高通用性、高特異性、高效地進行體外核酸拼接方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高通用性、高特異性、高效地進行體外核酸拼接方法。

本發明另一目的在于提供一種在體外簡便快速的預定粘端生成的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種核酸構建物(或核酸構建物組合)，所述的核酸構建物包括：

(a)第一核酸構建物，所述第一核酸構建物為雙鏈DNA構建物，并且所述第一核酸構建物的序列中含有至少一個式I所示的Cpf1識別切割元件；

D1-D2-D3 (I)

式中，

D1為前間區序列鄰近基序PAM；

D2為長度N2個核苷酸的Cpf1識別區，其中，N2為正整數14、15、16或17；

D3為長度為N3個核苷酸的Cpf1切割區，其中，N3為4-10的正整數；