[發(fā)明專利]一種多交叉恒溫擴增結(jié)合金納米生物傳感的核酸檢測技術(shù)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610872509.4
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN106399517B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉長蕓;王毅;王艷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;C12Q1/689;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 北京市眾天律師事務(wù)所 11478
• 代理人: 李新軍

1.一種非診斷目的的擴增目的基因片段并對擴增結(jié)果進行檢測的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)自所述目的基因片段的3’端起，設(shè)定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，設(shè)定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端設(shè)定第五任意序列C1，在所述第四任意序列P2的3’端設(shè)定第六任意序列C2s，在序列C1的3’端和5’端分別設(shè)定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分別設(shè)定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s；

(2)提供置換引物F1，所述引物F1含有與序列F1s互補的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和與序列P1s互補的序列P1，提供置換引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互補的序列C2和序列P2；

(3)提供擴增引物，所述擴增引物包括含有序列C1的擴增引物C1，含有與序列C2s互補的擴增引物C2，含有序列D1的擴增引物D1、含有序列R1的擴增引物R1、含有與序列D2s互補的擴增引物D2和含有與序列R2s互補的擴增引物R2，其中，在所述擴增引物C1的5’端標(biāo)記生物素，在所述擴增引物D1的5’端標(biāo)記熒光素或地高辛；

(4)在鏈移位型聚合酶、解鏈溫度調(diào)節(jié)劑、引物存在下，使用目的基因片段作為模板恒溫擴增DNA；

(5)使用金納米生物傳感器檢測步驟(4)的擴增產(chǎn)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述金納米生物傳感器包括一背板，在所述背板上依次設(shè)置裝有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜及吸水墊，在所述硝酸纖維素膜上依次設(shè)置檢測線1、檢測線2及控制線，在金標(biāo)墊、檢測線1、檢測線2及控制線區(qū)域依次包被有金納米粒子偶聯(lián)的鏈霉素親和素、抗熒光素抗體、抗地高辛抗體及生物素偶聯(lián)的牛血清蛋白。

3.權(quán)利要求1或2所述的方法在檢測沙門菌中的應(yīng)用，其特征在于，所述置換引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置換引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示，引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:12所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:13所示。

4.權(quán)利要求1或2所述的方法在檢測志賀菌中的應(yīng)用，其特征在于，所述置換引物F1的序列如SEQ ID NO:14所示，所述置換引物F2的序列如SEQ ID NO:15所示；所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:16所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:18所示，引物C1的序列如SEQ ID NO:19所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:20所示，引物D1的序列如SEQ ID NO:22所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:23所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:25所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:26所示。

5.權(quán)利要求1或2所述的方法在檢測多種目的基因片段中的應(yīng)用，其特征在于，提供針對多個不同目的基因片段的步驟(2)和(3)所述的交叉引物CP1、CP2，置換引物F1、F2，擴增引物C1、C2、D1、D2、R1和R2。

6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，所述多種目的基因片段分別為沙門菌的invA基因和志賀菌的ipaH基因。