[發明專利]一種誘導成纖維細胞轉分化為神經細胞的方法

有效

• 申請號: 201610871283.6
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN106399248B
• 公開（公告）日: 2020-01-14
• 發明（設計）人: 郭國驥;韓曉平;李俠;張芬;岑燕紅
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/071;C12Q1/02
• 代理公司: 33224 杭州天勤知識產權代理有限公司
• 代理人: 胡紅娟

1.一種誘導成纖維細胞轉分化為神經細胞的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)小鼠胚胎成纖維細胞的制備步驟如下：

1)培養器皿的預處理：以0.2％明膠覆蓋培養皿的底壁，室溫下放置30min后，將0.2％明膠吸出，室溫下備用；

2)給孕13.5天的小鼠注射約0.5mL阿佛丁麻醉后，實施斷頸法處死小鼠，將其浸入75％酒精中消毒5分鐘；

3)用75％乙醇擦拭腹部，剪開皮膚并把皮膚向后拉，暴露出腹壁，剪開腹壁以暴露出子宮，將子宮移到100mm的皿里，用10mL PBS洗三遍；

4)用剪刀剪開胚囊，并將胚胎移到培養皿中；

5)小心去除胚胎的頭和內臟，將胚胎軀干部分轉移到青霉素小瓶中，用2mL PBS洗三遍；

6)用眼科剪將組織剪碎，加入2mL的0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA，將懸液移入50mL離心管中，并在37℃孵育大約20min，每隔5min振蕩幾下；

7)充分吹打后加入10mL培養基終止消化，靜置5min后，將上層約8mL的細胞懸液移入培養皿中，置37℃，5％CO2培養6h后，換液；

8)細胞約90％匯合時傳代；

(2)將步驟(1)制備的小鼠胚胎成纖維細胞接種在35mm細胞培養皿上，每個培養皿接種20000個細胞，其培養基為基礎培養基；第二天，更換培養基，并加入誘導小分子組合6TCF，每4天更換一次添加誘導小分子組合6TCF的培養基；第9天至第24天，更換為添加誘導小分子組合6TCF和8CFV的培養基，第24天獲得神經細胞；

其中，誘導小分子組合6TCF中各組分的使用濃度為：5μM E616452、5μM苯環丙胺、10μMCHIR99021、10μM毛喉素；誘導小分子組合8CFV中各組分的使用濃度為：0.5μM A-83-01、10μM CHIR99021、10μM毛喉素、500μM VPA。