[發明專利]一種無核葡萄果實細胞計數方法

在審

• 申請號: 201610868615.5
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN106644896A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 李疆;李鵬;田嘉;羅淑萍
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: G01N15/10
• 分類號: G01N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種無核葡萄果實細胞計數方法，其特征是先用游標卡尺測量無核葡萄的縱莖Z、橫莖H和側莖C，之后用超薄刮胡刀片切取無核葡萄橫切組織，迅速固定在FAA固定液中，換3次固定液，之后經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、半自動切片機切片、展片、梯度二甲苯脫臘、梯度酒精復水、番紅-固綠染色、脫水、封片、烘片等操作之后制作成永久切片，再將永久切片放在顯微鏡下拍片，利用軟件對細胞大小進行分析，計算出果肉細胞數目。

2.根據權利要求1所述的“用超薄刮胡刀片切取無核葡萄橫切組織”，其特征在于將在果心上方0.3~0.4 cm處將無核葡萄沿橫切方向切開，再在果心下方0.3~0.4 cm處將無核葡萄沿橫切方向切開，最后將包含果心的部分四等分。

3.根據權利要求1所述的“迅速固定在FAA固定液中，換3次固定液”， 其特征在于FAA固定液的配方師65%酒精：40%甲醛溶液：冰醋酸=89:6:5，組織材料質量和固定液體積比在1:5~10，第2天后更換一次固定液，第7天后更換一次固定液，第15天后固定完成，可保存在4±0.5℃冷藏柜中備用。

4.根據權利要求1所述的“經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、半自動切片機切片”， 其特征在于取FAA固定液中固定好的樣品3~5塊于潔凈的青霉素瓶中，用5 mL 50%乙醇溶液浸洗固定好的無核葡萄果肉組織1h→依次用5 mL 的65%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、乙醇浸泡2h→新的乙醇浸泡1h→分別在乙醇和二甲苯體積比例依次為2∶1，1∶1，1∶2的混合溶液中各浸泡2h→純二甲苯中浸泡2h→新的5 mL純二甲苯中浸泡1h→將無核葡萄材料連同二甲苯倒入小蠟杯中，加入4 g碎蠟→放在42℃烘箱中，浸泡12 h→再往小蠟杯中加入1 g石蠟，將烘箱調成50℃，浸泡12h→將烘箱調成64℃，倒掉小蠟杯中的液體，往小蠟杯中倒入過濾干凈的熔點為60~62℃的蠟液，每12 h更換一次過濾干凈的熔點為60~62℃的蠟液，一共更換3次→用常規石蠟切片法將無核葡萄果肉切成16μm厚。

5.根據權利要求1所述的“番紅-固綠染色”， 其特征在于提前2個月將5.0 g番紅溶入500 ml 50%乙醇溶液中，過濾后保存在棕色瓶中，每7天搖勻一次；固綠溶液，提前2個月將2.5 g固綠溶入500 ml 95%乙醇溶液中，過濾后保存在棕色瓶中避光保存，每7天搖勻一次。

6.根據權利要求1所述的“利用軟件對細胞大小進行分析，計算出果肉細胞數目”， 其特征在于在顯微鏡下選取無核葡萄果肉部分，計數一定面積S（10倍目鏡×20倍物鏡的視野面積約是0.26 mm²）內的果肉細胞數目N（單位面積邊界處的細胞運用四舍五入計數法計數，大部分在單位面積內的記作1，小部分在單位面積內的記作0)。

7.則單個細胞的平均面積S_（均）=S/N，則所測庫爾勒果實細胞數目為：

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