[發明專利]一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法

有效

• 申請號: 201610868019.7
• 申請日: 2016-09-30
• 公開（公告）號: CN107045019B
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: 馬莉;葉生亮;李長清;曹海軍;王宗奎;劉鳳娟;張賢達
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院輸血研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 房云;易小藝

1. 一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法，其特征在于：包括以下具體步驟：

步驟一：待測樣品預處理：

（1）雙鏈Fc片段的純化：取IVIG，酶切、蛋白G層析和分子篩層析后得到雙鏈Fc片段；酶切條件為在IVIG中加入EDTA-Na₂，L-半胱氨酸鹽酸鹽和木瓜蛋白酶，37℃，4h，EDTA-Na₂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和木瓜蛋白酶用量比為1：5：20；分子篩層析為將蛋白G層析柱層析后收集的含Fc片段的組分，上樣于分離范圍包含5000Da-300000Da的分子篩，將樣品中的各組分按照分子量分離開來，收集分子量為50000Da的蛋白，即為完整的雙鏈Fc片段；

（2）IVIG去除糖類保護劑處理；取IVIG，分子篩層析去除糖類保護劑；再將去除糖類保護劑后的IVIG和純化后的雙鏈Fc片段分別進行步驟二至步驟五處理，得IVIG中的唾液酸總含量和Fc片段的唾液酸含量；

步驟二： 唾液酸解離：用酸性溶劑將待測樣品的唾液酸解離下來；

步驟三：熒光衍生，將DMB衍生液加入步驟二中，50℃金屬浴避光反應2.5h；

步驟四：高效液相色譜檢測和標準曲線的繪制：用高效液相色譜儀進行檢測，再以標準曲線樣品梯度濃度為橫坐標，標準曲線樣品經高效液相色譜檢測的衍生峰面積為縱坐標，采用線性方程繪制標準曲線；

步驟五：唾液酸含量的計算：

將待測樣品的經高效液相色譜檢測的衍生峰面積代入標準曲線，計算樣品中每毫升溶液唾液酸含量，將計算的結果除以樣品溶液的蛋白濃度，即得到每mg樣品中唾液酸含量；

其中，Fab段唾液酸含量為=（IVIG中的唾液酸總含量×IVIG分子量-Fc片段的唾液酸含量×Fc片段分子量）/Fab片段分子量；式中，IVIG分子量為150, 000 Da，Fc片段分子量為55, 000 Da，Fab片段分子量為95, 000 Da。

2.根據權利要求1所述的一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法，其特征在于：所述步驟一中待測樣品溶液蛋白濃度為0.5~4mg/ml 。

3.根據權利要求2所述的一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法，其特征在于：所述步驟一中待測樣品溶液蛋白濃度0.5~2mg/ml。

4.根據權利要求3所述的一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法，其特征在于：所述步驟一中待測樣品溶液蛋白濃度為0.5mg/ml。

5.根據權利要求1所述的一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法，其特征在于：所述唾液酸解離步驟為取300μL的 1mg/ml待測樣品加入100μL 0.1M三氟乙酸，金屬浴80℃，1h，產物經0.22μm濾膜過濾 。

6.根據權利要求1所述的一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法，其特征在于：所述高效液相色譜儀中色譜柱：Waters Symmetry C18 液相色譜柱4.6×250 5μm ，柱溫30℃，熒光檢測器激發波長373nm，發射波長448nm，流動相為甲醇、乙腈和超純水，其中甲醇：乙腈：超純水=7:8:85，流速為0.9mL/min。

7.根據權利要求1所述的一種IVIG中IgG Fab片段和Fc片段唾液酸含量的測定方法，其特征在于：所述標準曲線的繪制中1mg唾液酸標準品加10mL水配制成0.1mg/mL的唾液酸標準溶液，加水分別稀釋至5、10、20、30、40ug/mL，取300μL各濃度標準品溶液，分別加入50μLDMB衍生液，50℃金屬浴避光反應2.5h，20μL進樣檢測。