[發明專利]OsMTP11基因在改良水稻轉運錳離子能力中的應用

在審

• 申請號: 201610856240.0
• 申請日: 2016-09-27
• 公開（公告）號: CN107868122A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 陳熙;張煒;馬剛
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 傅婷婷,徐冬濤

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及OsMTP11基因在改良水稻轉運錳離子能力中的應用。

背景技術

錳是植物生長和發育所必需的營養元素之一,它直接參與植物光合作用中電子傳遞系統的氧化還原過程及PSII系統中水的光解；同時,錳是超氧化物歧化酶(SOD)活性所必需，對維持葉綠體膜正常的結構有重要的作用。另外，錳離子還是苯丙氨酸解氨酶和硝酸還原酶等酶的輔助因子。盡管錳作為一種營養元素對植物生長具有它的重要性，但是植物對錳的吸收量往往會超過需求量而導致植物中毒，這主要發生在酸性土壤或是還原性高的土壤中。據統計，全世界約有40％的可耕地屬酸性土壤,我國約有203萬平方公里酸性土壤，約占全國耕地面積的21％。在酸性土壤條件(pH<5.5)下,可溶性錳含量增加易導致植物遭受錳的毒害。研究表明，錳毒是酸性土壤上僅次于鋁毒的限制因素。我國南方大面積的酸性土壤、一些礦區土壤及由于長期淹水、氧化還原電位低，大量的錳在土壤中積累，從而嚴重影響作物生長發育與產量。

目前,研究認為植物的錳耐性和累積機制包括區域化作用、有機酸的螯合、限制吸收和外排作用、抗氧化作用以及離子的交互作用等，其中一些金屬轉運蛋白在這個過程中發揮了重要的作用。轉運蛋白在細胞水平上參與錳向細胞內的轉運和向不同細胞器(葉綠體和線粒體等)的釋放,以及錳離子在內膜系統(液泡、高爾基體和內質網等)的屏蔽作用；而在整個植株水平上參與植物對錳的吸收、長距離運輸和在地上部的累積過程。

與其它作物相比，水稻是比較耐錳的作物，這很可能是因為其長期生活在淹水土壤中形成的機制，但是具體耐性機理仍不完全清楚。目前水稻中發現一些與錳轉運相關的蛋白基因，如OsNRAMP5、OsYSL6、OsYSL2等，很可能與錳的解毒機制有關。

金屬耐受蛋白(MTP，Metal tolerance protein)屬于CDF(cation diffusion facilitator)家族中的離子轉運蛋白。CDF家族是一個陽離子轉運蛋白家族，可以增強植物器官對Zn²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Ni²⁺的耐性,該家族成員廣泛分布于細菌、真菌、動物及植物中，與生物對金屬耐受和細胞內金屬離子平衡密切相關，影響細胞內金屬離子的積累、金屬離子的耐受、信號傳導、抵抗氧化脅迫和蛋白質周轉等功能。目前為止還沒有在水稻中發現參與錳離子運輸的MTP蛋白基因。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供OsMTP11基因在改良水稻轉運錳離子能力中的應用。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

OsMTP11基因在改良水稻轉運錳離子能力中的應用。

OsMTP11基因在構建抗錳脅迫的轉基因水稻中的應用。

一種構建耐錳水稻的方法，將OsMTP11基因轉入錳離子敏感的水稻中獲得耐錳水稻。

有益效果：

本發明通過酵母突變株互補試驗說明OsMTP11具有轉運錳離子的功能，結合過表達、干擾OsMTP11的植株以及T-DNA插入的突變體的表型分析和離子含量測定，進一步驗證了OsMTP11具有轉運錳離子的功能。在水稻原生質體中的表達以及相關抑制劑處理，發現OsMTP11定位于反面高爾基體網狀結構上。在錳脅迫的情況下，OsMTP11能從反面高爾基體網狀結構遷移到質膜上去，推測OsMTP11通過胞吐的方式把錳離子轉運到細胞膜外。以上結果顯示OsMTP11是水稻中的一個錳離子轉運蛋白，能夠通過外排的方式減少水稻中錳離子的含量來達到減緩水稻受到錳毒害的水平。同時過表達OsMTP11相當于野生型水稻更能耐受錳毒害，為水稻中錳毒害的研究提供了理論基礎以及為今后的水稻育種提供了思路和材料儲備。

附圖說明

圖1 OsMTP11能夠互補錳離子缺陷型酵母突變體的耐錳性

(A)酵母突變株pmr1(Mn),zrc1D(Zn),cot1D(Co),cup2D(Cu),ycf1(Cd)中轉入OsMTP11基因，能夠互補pmr1的生長。

(B)分別轉化空載以及pYES2-OsMTP11質粒的△pmr酵母突變體在含有3mM錳元素的SD-Ura的液體培養基中生長24h，起始OD₆₀₀＝0.3，之后測定酵母生長曲線。