[發明專利]基于納米抗體及免疫磁分離檢測谷物中赭曲霉毒素A方法

有效

• 申請號: 201610852241.8
• 申請日: 2016-09-26
• 公開（公告）號: CN106468712B
• 公開（公告）日: 2018-11-16
• 發明（設計）人: 劉星;陳健;曹獻英;孫志昶;唐宗文;馬新輝;舒楊
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/68
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙) 11491
• 代理人: 姜彥

1.一種基于納米抗體及免疫磁分離檢測谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，該基于納米抗體及免疫磁分離檢測谷物中赭曲霉毒素A的方法包括以下步驟：

采用化學共沉淀法合成磁性納米顆粒，采用EDC/NHS法將納米磁珠的羧基與抗OTA納米抗體上的氨基偶聯，制得用于富集谷物樣品中OTA的高偶聯比免疫磁珠和參與免疫反應體系的低偶聯比免疫磁珠；

利用免疫磁珠富集技術對待測樣品進行前處理后，得到低偶聯比免疫磁珠和OTA的混合物；

再結合磁珠斑點免疫法，以PVDF膜為固相基質，將OTA-OVA檢測抗原點樣于PVDF膜基質上，以抗Histag抗體作為對照，封閉處理；

將處理好的PVDF膜投入免疫磁珠和OTA的混合物進行反應，磁珠以抗體標記物的形式參與免疫反應，樣品混合物中的游離OTA與膜上的OTA-OVA抗原競爭結合免疫磁珠；

以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判斷樣品中的OTA含量；

利用免疫磁珠富集技術對待測樣品進行前處理方法為：

稱取5g粉碎后的谷物樣品，加入20mL50％甲醇-PBS，劇烈震蕩提取10分鐘，離心分離上清，PBS稀釋一定比例后加入高偶聯比免疫磁珠進行孵育；

磁分離除去上清，用1mLPBS洗滌一次；磁珠重懸于120μLPBS中，90℃水浴10min使抗體變性并洗脫OTA，向洗脫溶液中加入10μg低偶聯比的免疫磁珠并充分混合。

2.如權利要求1所述的基于納米抗體及免疫磁分離檢測谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，納米磁珠與抗OTA納米抗體偶聯方法為：

1mg磁珠用500μLMEST洗滌兩次；

400μLMES重懸磁珠后加入0.5mgEDC和0.5mgNHS，置于混勻儀上保持懸浮狀態，37℃活化1h；

磁分離去上清，500μLMEST洗滌兩次，PBST重懸后加入40μg抗OTA納米抗體，4℃攪拌反應過夜；

偶聯產物與乙醇胺37℃混勻1h；

PBST洗滌3次后加1mLPBST重懸，4℃保存；

將上述制備的免疫磁珠稀釋到合適濃度，進行電鏡表征和紫外掃描。

3.如權利要求2所述的基于納米抗體及免疫磁分離檢測谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，所述的MEST為：10mMMES,0.05％Tween20,pH6.0；

所述的MES為：10mM,pH6.0；

所述的PBST為0.01MPBS,0.01％Tween20,pH7.4；

所述的乙醇胺體積比為2％的溶液；

所述PBST洗滌3次后加1mLPBST中，1mL的PBST含0.5％BSA和0.02％NaN₃。

4.如權利要求1所述的基于納米抗體及免疫磁分離檢測谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，磁珠斑點免疫法的建立方法包括：

PVDF膜前處理：

用鉛筆在PVDF膜上畫出膜反應區；將PVDF膜置于甲醇中浸泡15s后取出，再用超純水漂洗2min；

將兩層濾紙平鋪于操作臺上，加入3mLPBS，使濾紙潤濕，并用干燥的濾紙吸收多余的PBS，使臺面與濾紙間無氣泡；將用超純水漂洗處理后的膜放在濕濾紙上，用光滑的玻璃試管在濾紙與膜上滾動，使濾紙與膜間無氣泡；

用移液器將3μL檢測抗原點在膜反應區的中心位置，靜置10秒后放入濕盒中，37℃孵育2h；將膜浸泡于5％脫脂牛奶中封閉1h，用PBST漂洗，晾干，并儲存于4℃備用。

5.如權利要求1所述的基于納米抗體及免疫磁分離檢測谷物中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，以磁珠在PVDF膜聚集OTA-OVA量的多少判斷樣品中的OTA含量方法為：

將封閉好的PVDF膜浸入免疫磁珠-OTA混合液中，在水平搖床上室溫反應；取出PVDF膜，PBST洗滌3次，樣品中的OTA含量越高，能夠與膜上OTA-OVA聚集結合的磁珠量越少；洗去未結合的磁珠，判斷結果。