[發明專利]人工合成的對鱗翅目害蟲高毒力的mcry1Ba、mcry1Ia基因序列及基因組合

有效

• 申請號: 201610847168.5
• 申請日: 2016-09-23
• 公開（公告）號: CN106318954B
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 郎志宏;張杰;楊麗梅;李圣彥;汪海;黃大昉;宋福平
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/32
• 分類號: C12N15/32;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/20
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

本發明為“人工合成的對鱗翅目害蟲高毒力的mcry1Ba、mcry1Ia基因序列及基因組合”，屬生物防治技術領域。本發明提供的兩種對鱗翅目害蟲具有高毒力的Bt cry1Ba基因和Btcry1Ia基因的人工優化、改造并合成的新的DNA序列(見序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)，以利用植物偏好的密碼子序列，提高Bt cry1Ba基因和Bt cry1Ia基因在轉基因過程中的轉化成功率，同時提高在轉基因植物中的表達量和穩定表達的特性，通過雙基因的組合應用提高基因的殺蟲活性。本發明利用組成型表達的啟動子構建了新的植物表達載體，轉化率高，表達量高且穩定，可用于轉基因植物的研究。

技術領域

本發明屬于生物防治技術領域，特別是涉及人工合成的對鱗翅目害蟲高毒力的mcry1Ba、mcry1Ia基因序列及基因組合。

背景技術

蟲害是世界農作物減產的一個重要因素，平均每年因此損失糧食總產量的10％左右，直接經濟損失達100億美元以上。過去幾十年的防治主要依賴化學農藥，在為農業生產做出巨大貢獻的同時，化學農藥卻造成了環境污染、人畜中毒、生態失衡等嚴重后果。在這些巨大的代價面前，全球都在尋找和開辟新的病蟲害防治策略和技術。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌。它在形成芽胞的同時，能產生蛋白性質的伴胞晶體(parasporal crystal)，對鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf E.et al,1998,Microbiology andMolecular Biology Review,62(3):775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)又稱δ-內毒素(Delta-endotoxin)，在昆蟲中腸首先溶解，成為原毒素，之后被腸道蛋白酶降解為具有專一活性的毒素，與中腸上特異的受體進行結合(Craig,2007,Microbiology and Molecular Biology Review,71(2):255–281)，導致昆蟲死亡，蘇云金芽胞桿菌對人畜無害，不污染環境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了廣泛應用。

目前人們已經克隆了825多種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬318種模式基因(可參見http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt//holo2.html)。

1987年，Vaeck等人首次將Bt殺蟲晶體蛋白基因轉入煙草，開創了人類利用轉基因技術防治害蟲的先河(Vaeck et al,1987，Nature,328:33-37)。但是在轉基因研究中人們發現將來源于Bt的殺蟲蛋白基因直接轉入植物，存在著表達產物不穩定、表達量少的缺陷(van Aarssen et al,1995,Plant Molecular Biology,28:513-524)。具體問題包括：1)天然Bt基因高含AT，超過60％，在植物體內這樣的基因表達的mRNA極易被植物降解；2)天然Bt基因中存在類似真核基因的內含子切點、轉錄終止子序列，從而造成轉錄不完整、mRNA異常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密碼子與植物存在較大差異，會造成蛋白翻譯效率降低；4)天然Bt基因作為原核生物來源的基因，其結構與植物等真核生物差異顯著，如真核生物含有5’-UTR序列，3’末端的polyA尾序列。因此，這些關鍵問題的解決是實現Bt基因在植物中高效、穩定表達的重要保證。隨著這些技術的改進和完善，自1996年來的二十年內，轉基因抗蟲玉米、馬鈴薯、水稻等作物相繼研制成功，并逐步進入應用階段(James C，ISAAABriefs，2016)。