[發明專利]重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP及診斷試劑盒

有效

• 申請號: 201610838052.5
• 申請日: 2016-09-21
• 公開（公告）號: CN106318915B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發明（設計）人: 谷明;張婧
• 申請（專利權）人: 重慶宇珩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/65;C12Q1/70;C12Q1/06;G01N15/14;C12R1/93
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發明公開了一種重組單純皰疹病毒HSV?hTERTp_ICP4_LungCA?GFP及其對應的診斷試劑盒，所述病毒的基因組上的端粒酶逆轉錄酶啟動子和ICP4基因之間插入長度為25bp的DNA片段，且ICP34.5位點插入了GFP表達盒，其中，DNA片段序列為AGCAGGACCTCGCCCTTGGGACGAC。該病毒具有選擇性地高滴度繁殖力，病毒在肺癌細胞繁殖滴度穩定在10⁶以上。本發明用合成的隨機核苷酸短序列與HSV1?hTERTp_ICP4病毒基因組進行定點重組(在hTERTp與ICP4之間)。短序列的改變不但可以增加病毒的繁殖滴度，還可以使不同病毒針對不同類型腫瘤細胞產生選擇性地高滴度繁殖。如有的病毒在肺癌細胞繁殖較好，有的病毒則在肝癌細胞產生更高的滴度等等。

技術領域

本發明涉及重組單純皰疹病毒，具體地指一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP及其對應的診斷試劑盒。

背景技術

端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結構，其作用是維護染色體結構穩定，包括防止染色體末端融合，保護染色體結構基因和避免遺傳信息在復制中丟失。端粒酶是由小分子RNA和蛋白質組成的逆轉錄酶,能利用自身RNA為模板合成端粒DNA,彌補隨細胞有絲分裂逐漸縮短的端粒。其有三個主要組成部分：人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)、端粒酶相關蛋白(telomerase-associated protein,TP1/TLP1)、人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。端粒酶RNA在大多數細胞中都表達,而人端粒酶逆轉錄酶是端粒酶的限速成分，僅在端粒酶陽性的細胞中表達，與端粒酶活性相關。盡管一些腫瘤細胞在重組時通過替代性端粒延長(alternative lengthening oftelomeres,ALT)機制來維持端粒長度,但仍有90％以上的腫瘤細胞通過上調hTERT來活化端粒酶，而且hTERT僅在極少數正常體細胞中表達。現已知端粒酶啟動子(hTERTp)僅在端粒酶活性高的細胞中啟動轉錄過程，這就為腫瘤靶向治療提供了一個很好的契機。

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)表達的感染細胞蛋白(infectedcell proteins,ICPs)分為三個等級：初始(immediate early,IE)、早期(early)和晚期(late)。其中IE蛋白是影響病毒復制的關鍵蛋白，包括：ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47，而其中ICP4是最關鍵的復制相關蛋白。如果將ICP4基因的固有啟動子置換成hTERTp，就有可能使HSV選擇性地在腫瘤細胞內繁殖。

人工合成人端粒酶逆轉錄酶啟動子(hTERTp)以替換實驗室現有I型溶 瘤單純皰疹病毒(17+毒株)基因組中ICP4原啟動子，構建出一種新型病毒HSV-hTERTp_ICP4。該重組病毒能選擇性地在人腫瘤細胞內生長繁殖，而不在人的正常細胞中繁殖。

構建含hTERTp_ICP4表達盒的質粒是構建的HSV-hTERTp_ICP4病毒的基礎，用含hTERTp_ICP4表達盒的質粒，我們構建了原始的HSV-hTERTp_ICP4，該重組病毒雖然可以選擇性地在腫瘤細胞內繁殖，但繁殖滴度較低(10⁴/ml)。

為了解決繁殖滴度較低的缺陷，迫切需要構建一種繁殖滴度較高的病毒。

發明內容

本發明所要解決現有病毒繁殖滴度較低的缺陷，提供了一種重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP，該病毒具有選擇性地高滴度繁殖力，病毒在肺癌細胞繁殖滴度穩定在10⁶以上。

本發明還提供了一種由重組單純皰疹病毒HSV-hTERTp_ICP4_LungCA-GFP制備得到的診斷試劑盒。