[發(fā)明專利]氟尿嘧啶療效相關(guān)基因基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610834343.7
• 申請(qǐng)日: 2016-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN107868819A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田曉麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波美麗人生醫(yī)藥生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6876
• 分類號(hào): C12Q1/6876;C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及藥物紫杉醇療效相關(guān)基因OPRT，MTHFR和DPYD基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

雖然5-FU的抗腫瘤療效已得到廣泛肯定，但在5-FU臨床應(yīng)用中，時(shí)常出現(xiàn)治療有效率較低和副作用大的問題。科學(xué)研究證明氟尿嘧啶類藥物的療效和副作用存在顯著的個(gè)體差異：患者本身遺傳特征的差異是主要的原因之一。

OPRT的主要作用基因定位于人類染色體3q13，主要存在于肝臟中，是一個(gè)關(guān)于嘌呤、嘧啶和核苷酸合成的酶。OPRT基因的高表達(dá)能增加腫瘤組織對(duì)5’Fu化療的敏感性，OPRT的基因表達(dá)和酶活性都與基于5’FU的化療敏感性密切相關(guān)。OPRT存在Gly213Ala基因多態(tài)性，攜帶Ala/Ala(C/C)純合等位基因型的患者比攜帶Ala/Gly(G/C)和Gly/Gly(G/G)等位基因患者對(duì)5-FU的毒性反應(yīng)更明顯，因此不適合進(jìn)行氟尿嘧啶藥物治療。

二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-Fu分解代謝和清除的限速酶，DPD活性降低或缺乏時(shí)，5-Fu的系統(tǒng)清除率降低。在此狀態(tài)下用5-Fu治療，可引發(fā)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)；酶活性越低，毒性反應(yīng)程度愈高。研究發(fā)現(xiàn)其藥理學(xué)基礎(chǔ)是-二氫嘧啶脫氫酶基因(DPYD)遺傳缺失的不同。在DPYD多態(tài)性位點(diǎn)中，有雜合型，野生型和變異型突變；且毒副作用發(fā)生率從高到低依次均為突變型、雜合型和野生型。可取上述位點(diǎn)指導(dǎo)應(yīng)用5-FU個(gè)體化治療。二氫嘧啶脫氫酶基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)5-FU化療的毒副反應(yīng)有一定的指導(dǎo)意義，從而指導(dǎo)個(gè)體化用藥。

MTHFR(亞甲基四氫葉酸還原酶)是胞內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，MTHFR基因存在功能性SNP，即C677T(突變型患者對(duì)5-FU敏感性較高)。

關(guān)于基因突變檢測(cè)方法有很多，各國學(xué)者對(duì)此都進(jìn)行了大量研究。己經(jīng)報(bào)道的方法包括直接測(cè)序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、Scorpions ARMS、TaqMan PCR、ME-PCR等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中在臨床和科研中較為常用的方法為直接測(cè)序法以及ARMS(Amplification refractory mutation system,擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng))法。

直接測(cè)序法檢測(cè)能力有限，其檢測(cè)靈敏度約20％左右，而且步驟復(fù)雜，整個(gè)檢測(cè)過程涉及PCR-電泳-測(cè)序-測(cè)序結(jié)果的解讀等一系列的步驟，費(fèi)吋費(fèi)力，但是該方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠發(fā)現(xiàn)一些新的未知突變。

ARMS方法是將分子信標(biāo)(探針)與特異性的ARMS引物相結(jié)合創(chuàng)造出來的，ARMS引物3’端設(shè)計(jì)在突變位點(diǎn)，最后一個(gè)堿基與突變堿基配對(duì)，釆用無3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特異性的識(shí)別引物的3’末端，只有引物3’末端完全配對(duì)時(shí)，才能正常擴(kuò)增，當(dāng)引物3’末端發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，不能有效的擴(kuò)增。當(dāng)引物與突變模板結(jié)合并延伸出相應(yīng)的產(chǎn)物后，探針兩端的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離而產(chǎn)生熒光。目前，市場(chǎng)上相關(guān)試劑盒包括QIAGEN公司和廈門艾德公司，價(jià)格昂貴。

因此，本研究釆用ARMS技術(shù)與SYBR染料相結(jié)合的方法，研發(fā)出一種擁有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)并且能夠快速、敏感而且簡(jiǎn)便的檢測(cè)氟尿嘧啶療效相關(guān)基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多態(tài)性的試劑盒。通過自己研發(fā)設(shè)計(jì)ARMS引物以及將Scorpions探針換為SYBR染料以使檢測(cè)成本大大降低，這樣更適合中國患者OPRT、MTHFR和DPYD基因多態(tài)性的檢測(cè)。綜上所述，該檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法是一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確的氟尿嘧啶療效相關(guān)基因(OPRT、MTHFR和DPYD)基因多態(tài)性檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容：