[發明專利]分離核酸的方法

在審

• 申請號: 201610828219.X
• 申請日: 2009-05-12
• 公開（公告）號: CN106834273A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: C·瑞特;M·霍利茨;M·斯普倫加-豪斯塞爾
• 申請（專利權）人: 恰根有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 陶家蓉,崔佳佳

本發明專利申請是國際申請號為PCT/EP2009/003364，國際申請日為2009年5月12日，進入中國國家階段的申請號為“200980120955.8”，發明名稱為“分離核酸的方法”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及分離和/或純化核酸，特別是短鏈核酸的方法。

背景技術

通常按照均勻基本模式分離植物、動物或人材料的核酸，例如DNA和RNA：首先部分利用降解蛋白質的酶斷裂含有核酸的所述起始材料。隨后采用各種方法除去各成分。此外，可在其中核酸是游離形式，即它們不在細胞內的樣品材料中分離它們。因此，游離核酸可能在人工樣品混合物中產生，也可能在天然樣品，例如血液中產生。此類自由循環的核酸也稱為胞外核酸。

純化所述核酸的大多數現有技術方法依據以下兩種分離原理：

典型的方法依據一步過程，包括加入含有離液劑(在大多數情況中)和有機萃取劑(通常是苯酚和/或氯仿)的緩沖液后進行提取。不希望的相伴物質與有機相一起棄去。然后可通過分開諸相取出保留在水相中的核酸，從而分離核酸。利用毒性和有害物質，例如苯酚和/或氯仿導致該過程的重要缺點是核酸水性溶液中殘留水溶性物質作為污染物，從而不得不再采用極其費時的純化步驟除去。

因此，鑒于這些缺點，現有技術建立了備選方法，該方法依據將核酸選擇性吸附于固體支持性材料，例如二氧化硅。如果需要，裂解含核酸的起始材料，在限定條件下與所述支持材料接觸以使該核酸結合該支持材料；適當時可進行洗滌步驟。隨后并任選借助合適緩沖液將結合支持物的核酸從該支持物上洗脫。

例如，US 5,234,809(Boom)公開了分離核酸的方法，該方法適合多種不同應用。其描述了通過培育含核酸的起始材料與離液緩沖液和DNA-結合固相從而分離所述起始材料的核酸的方法。如果需要，離液緩沖液裂解起始材料并使核酸結合固相。所述方法非常適于分離較小樣品量的核酸。WO 93/11221還描述了依據相似原理的方法。

現有技術公開了純化核酸的許多方法，包括混合固相與離液緩沖液。由于在所有已知方法中，長鏈核酸與固相的結合至少優于(在大多數情況中遠優于)短鏈核酸(例如，長度小于1000bp、500bp或甚至300bp)，現有技術方法不適于有效純化，甚至不適于相對長鏈核酸濃縮短鏈核酸。

不適于純化短鏈核酸估計是因為所述短鏈核酸與支持材料的結合次于長鏈核酸(例如，基因組DNA)這一事實。因此，在大多數純化方法中，很大部分的短鏈核酸喪失，純化核酸中短鏈核酸不存在或不足。然而，對于某些應用，尤其需要相對于長鏈核酸而分離或濃縮短鏈核酸。

為優先濃縮短鏈核酸或分離短鏈核酸與長鏈核酸，現有技術中以前采用各種原理。例如，DE 10 2006 045 391描述了從短核酸中除去長核酸的方法，包括將樣品應用于特別設計的固相數次。另一方法依據利用含檸檬酸鹽而非離液鹽的特定結合緩沖液，以此方式結合短鏈核酸(WO 2007/065934)。

對于各種應用領域，純化/濃縮短鏈核酸(RNA和DNA)至關重要。短鏈核酸起關鍵作用的領域是產前診斷。除了內源性游離循環DNA外，妊娠婦女的血液也含胎兒的游離循環DNA。估計在妊娠婦女血液中游離循環的胎兒DNA與母親的游離循環DNA大小不同。雖然母體游離循環DNA的平均長度常大于500bp，主要的胎兒游離循環DNA顯著較小，平均長度為500bp。如果有合適的純化方法可用，則可利用胎兒和母體核酸之間的大小差異來濃縮進而更詳細地研究胎兒DNA。利用胎兒來源的游離循環DNA以供產前診斷優于經典方法，例如羊膜穿刺術或絨毛膜絨毛取樣在于其不危及胎兒，因此風險較低。然而，血液中胎兒來源的游離循環DNA量極低。根據妊娠階段，1ml血液含有20-260拷貝的胎兒DNA不等。因此，游離循環胎兒DNA的濃度較低，但仍高于游離循環胎兒細胞的濃度。當分離母體血液中的游離循環總DNA時，與游離循環的母體DNA相比，還存在游離循環胎兒DNA的濃度極低，因此只有一部分遺傳材料源自胎兒；而大多數分離的遺傳材料源自母親的問題。在許多情況中，母體DNA的背景高阻礙檢測胎兒基因部分，在一些情況中，即便與實時PCR一樣敏感的檢測方法的靈敏度亦不足以檢測胎兒DNA。