[發明專利]一種構建基因替代小鼠研究野生型和突變體非肌性肌球蛋白重鏈II功能的方法

有效

• 申請號: 201610823307.0
• 申請日: 2016-09-14
• 公開（公告）號: CN106399371B
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發明（設計）人: 王愛兵;王乃東;楊毅;劉譚彬;湛洋;雷新諾;劉偉;楊凌宸;雷紅宇
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 何為;周棟

本發明提供了一種構建基因替代小鼠研究野生型和突變體非肌性肌球蛋白重鏈II功能的方法。本發明改造的mpNTKV?LoxP載體更適合于構建基因打靶載體特別是基因替代目的，新加入的Pac I和Swa I都是識別八個堿基的限制性內切酶，有利于較大DNA片段的插入。構建的MYH9基因替代(即內源MYH9基因被外源編碼非肌性肌球蛋白重鏈II基因所替代)打靶載體通過電轉導入小鼠ES細胞中，經過藥物篩選，ES細胞單克隆挑選，Southern Blot或PCR鑒定，發生同源重組的陽性單克隆細胞率高達90％以上，易于獲得所需細胞系。使用陽性ES細胞顯微注射至小鼠囊胚獲得MYH9基因替代嵌合體小鼠，并且該嵌合體小鼠可以交配傳代，從而獲得MYH9基因替代雜合子及純合子后代。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種構建基因替代小鼠研究野生型和突變體非肌性肌球蛋白重鏈II功能的方法及其應用示范

背景技術

基因敲除是80年代末應用DNA同源重組原理發展起來的一種新型分子生物學技術，即通過一定的途徑使機體特定的基因失活或缺失的技術。該技術發展經歷了三個主要過程：即80年代初ES細胞分離和體外培養為基因敲除奠定了技術基礎；1985年首次證實哺乳動物細胞中同源重組現象的存在為基因敲除奠定了理論基礎；1987年完整的基于ES細胞的基因敲除小鼠模型的建立標志著該技術的成熟。在此基礎上發展起來的條件性或誘導性基因敲除體系使得對基因在時間和空間上的修飾更加明確、效果更加完美，從而在研究可能導致胚胎致死的一些重要基因，以及確切了解某個基因在特定發育階段或特定組織的功能中發揮了重要作用。近年來出現的依賴鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄因子樣效應物核酸酶(TALEN)和成簇規律間隔短回文重復及其關聯蛋白系統(CRISPR/Cas9)的基因組編輯技術進一步推動基因敲除的發展與應用。需要指出的是，這些新技術仍存在或是構建復雜、或是靈活性差、或是脫靶效應等問題，還處在不完全成熟階段。因此，時至今日基于ES細胞和利用DNA同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最可靠和最普遍的使用方法。

生物體內存在眾多的基因或蛋白家族，它們結構和功能相似。II型非肌性肌球蛋白(Nonmuscle Myosin II,NM II)是肌球蛋白超家族的一員，與actin結合構成細胞中的分子馬達。所有的myosinⅡ具有相似的結構，即由兩條重鏈(171-244kDa)、兩條調節輕鏈和兩條必需輕鏈(16-23kDa)組成的六聚體。兩對輕鏈結合于一對重鏈的氨基末端形成球形頭部，具有ATP酶活性以及actin結合位點；重鏈的羧基末端通過卷曲式螺旋形成桿狀尾部。哺乳動物中NM II分為三種亞型，這是由重鏈的不同而決定的。三個基因(MYH9,MYH10,MYH14)分別編碼NM重鏈II(Nonmuscle myosin heavy chain II，NMHC II)NMHCIIA，NMHCIIB和NMHCIIC。一對相同的重鏈與兩對輕鏈結合形成的六聚體復合物分別為NM IIA，NM IIB,NMIIC。NM II除了為細胞運動提供動力外，還參與細胞各種生理活動，如細胞的遷移與黏附、胞質分裂等。應用基因敲除技術在小鼠中分別將MYH9和MYH10基因失活，揭示這些NM II蛋白為小鼠早期發育所必需。同時，由于MYH9和MYH10基因敲除小鼠的胚胎致死性，限制了進一步了解這些蛋白在生物體內的功能；大多數細胞中表達不止一種NM II亞型，這些不同亞型NM II在體內特定功能仍不清楚；不同亞型NM II在細胞和組織中的表達存在一定的特異性，這是否造成它們功能的差異呢？此外，MYH9基因的單個點突變引起一類統稱為MYH9相關疾病，目前已知造成這類疾病的MYH9基因點突變就高達40多個，遍布在NMHC IIA蛋白各處，若逐個分析這些點突變造成疾病的原因將需要生產40多個相應的MYH9基因原點突變小鼠，工作無疑極其繁巨。采用基因替代策略，將有效探討、解決并回答上述問題。

發明內容

本發明旨在克服現有研究策略和技術方法的不足，提供一種構建基因替代小鼠研究野生型和突變體非肌性肌球蛋白重鏈II功能的方法。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：