[發明專利]大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體菌株，其構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201610821907.3
• 申請日: 2016-09-13
• 公開（公告）號: CN106399133B
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 田呈明;熊典廣;王永林;鄧成霖
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C12R1/645
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 喻蓉

1.大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)的VdKu80基因敲除突變體菌株VdXS11-ΔVdKu80，其特征在于，所述突變體菌株保藏號為CGMCC No.12873，并且所述變體菌株VdXS11-ΔVdKu80在表型上與野生型菌株相一致。

2.如權利要求1所述的大麗輪枝菌VdKu80基因敲除突變體菌株，其特征在于，所述VdKu80基因被潮霉素抗性基因所替代。

3.如權利要求1所述突變體菌株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)利用split-marker方法，按照如下步驟構建大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體：

1A)以大麗輪枝菌基因組DNA為模板，分別以2對PCR擴增特異性引物Ku80-5F/Ku80-5R、Ku80-3F/Ku80-3R為引物進行PCR擴增，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因上游片段VdKu80 5F和下游片段VdKu80 3F；其中，所述引物Ku80-5F的序列號為SEQ ID NO.1；所述引物Ku80-5R的序列號為SEQ ID NO.2所述引物Ku80-3F的序列號為SEQ ID NO.3；所述引物Ku80-3R的序列號為SEQ ID NO.4；所述上游片段VdKu80 5F的序列號為SEQ ID NO.36；所述下游片段VdKu80 3F的序列號為SEQ ID NO.37。

1B)以質粒gGFP為模板，以Hyg-For/Hyg-Rev為特異性引物進行PCR擴增，獲得潮霉素抗性基因片段Hygromycin片段，其中所述引物Hyg-For的序列號為SEQ ID NO.5；所述引物Hyg-Rev的序列號為SEQ ID NO.6；所述Hygromycin片段的序列號為SEQ ID NO.38；

1C)將VdKu80 5F、VdKu80 3F片段和Hygromycin片段分別與pMD^TM19-T Vector質粒進行連接反應，獲得VdKu80 5F重組質粒、VdKu80 3F重組質粒和Hygromycin重組質粒；

1D)以VdKu80 5F重組質粒為模板，以Ku80-5F/Ku80-5RO為引物，進行PCR擴增得到VdKu80 5FO片段，其中所述引物Ku80-5RO的序列號為SEQ ID NO.7；以VdKu80 3F重組質粒為模版，以Ku80-3FO/Ku80-3R為引物，進行PCR擴增得到VdKu80 3FO片段，其中所述引物Ku80-3FO的序列號為SEQ ID NO.8；以Hygromycin重組質粒為模版，以M13F/M13R為引物，進行PCR擴增得到HygromycinO片段，其中所述引物M13F的序列號為SEQ ID NO.9；所述引物M13R的序列號為SEQ ID NO.10；

1E)以VdKu80 5FO片段和HygromycinO片段為模板，以Ku80-5F/HY-R為引物，進行融合PCR擴增，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體1：VdKu80 5F+2/3Hyg片段，其中，所述引物HY-R的序列號為SEQ ID NO.11；以VdKu80 3FO片段和HygromycinO片段為模板，以YG-F/Ku80-3R為引物，進行融合PCR擴增，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因敲除載體2：2/3Hyg+VdKu803F片段，其中所述引物YG-F的序列號為SEQ ID NO.12；

2)利用PEG介導的方法，將VdKu80基因敲除載體導入野生型大麗輪枝菌XS11菌株的原生質體內，獲得大麗輪枝菌VdKu80基因敲除的轉化子；

3)利用PCR方法對大麗輪枝菌VdKu80基因敲除轉化子進行篩選。