[發明專利]一種產檸檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201610817882.X
• 申請日: 2016-09-12
• 公開（公告）號: CN107815424B
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發明（設計）人: 花強;韋柳靜;曹選;呂預備;陳駿
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P5/00;C12R1/645
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;蔣舫瑋

本發明公開了一種產檸檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用。該基因工程菌是將含有優化的基因LS和基因NDPS1的重組載體轉化尿嘧啶和亮氨酸營養缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)構建而成，所述優化的基因LS和NDPS1的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID No.1～2所示。在此基礎上同時過表達基因HMG1和基因ERG12，能使檸檬烯達到0.67mg/g DCW的極高產量。此外，通過對該基因工程菌兩相發酵時添加的丙酮酸和十二烷的濃度進行選擇，進一步提高檸檬烯的產量。該基因工程菌能用于大規模商業化生產，前景良好。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體地涉及一種產檸檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用。

背景技術

檸檬烯普遍存在于天然植物中，因具有令人愉悅的柑橘香味而在食物香精中得到廣泛的應用。在香料工業中，檸檬烯本身可用作配制人造橙花、甜花、檸檬、香檸檬油的原料，亦可作為新鮮的頭香香料。由于檸檬烯具備藥理活性，其在醫藥領域也有著廣泛的應用。同時檸檬烯也是噴氣燃料的一種替代品。另外其還是許多重要芳香物質和藥物比如紫蘇醇、香芹酮和薄荷醇等的前體。

檸檬烯的生產方法主要有天然提取法和微生物發酵法兩種。由于從工業廢棄物柑橘皮中提取的檸檬烯難免會有農藥殘留，不適合作為食品添加劑，因此微生物發酵生產檸檬烯具有明顯的優勢。特別是隨著生物技術的快速發展，利用微生物發酵生產檸檬烯及其衍生物成為目前研究的熱點之一。

一般通過外源引入檸檬烯合成酶基因生物發酵法生產檸檬烯，目前亟需高產檸檬烯的基因工程菌。

發明內容

本發明要解決的技術問題是為了克服現有技術中缺乏高產檸檬烯的基因工程菌的不足，提供一種產檸檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌及其應用。

發明人付出創造性勞動后發現，針對引入檸檬烯合成基因后解脂耶氏酵母產生檸檬烯的代謝途徑，將兩個檸檬烯合成相關基因——即來源于番茄，可將異戊烯基焦磷酸和甲基烯丙基焦磷酸縮合為橙花基二磷酸的基因NDPS1；和來源于藿香，可將橙花基二磷酸異構為檸檬烯的基因LS分別進行優化后，將這兩個優化的基因轉化解脂耶氏酵母能夠使其產檸檬烯。發明人進一步發現，在優化上述兩個基因的基礎上過表達將HMG-CoA還原為甲羥戊酸的基因HMG1，并同時過表達將甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因ERG12，能極大幅度地提高檸檬烯的產量(參見圖1)。此外，發明人發現特定的十二烷的添加量能夠在兩相發酵中更好地促進解脂耶氏酵母高產檸檬烯。

本發明提供的技術方案如下：

本發明的技術方案之一為：一種產檸檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其是將含有優化的基因LS和優化的基因NDPS1的重組載體轉化尿嘧啶和亮氨酸營養缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)構建而成，所述優化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示；所述優化的基因NDPS1的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本發明中，所述尿嘧啶和亮氨酸營養缺陷型解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)為本領域常規的尿嘧啶和亮氨酸營養缺陷型解脂耶氏酵母，即自身難以合成尿嘧啶和亮氨酸的解脂耶氏酵母。較佳地，所述尿嘧啶和亮氨酸營養缺陷型解脂耶氏酵母為解脂耶氏酵母Po1f，其按照Madzak C,Tréton B and Roland SB.Strong hybrid promoters andintegrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression ofheterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.J Mol MicrobiolBiotechnol.2000,2(2):207-216中記載的制備方法制得。