[發明專利]一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法

在審

• 申請號: 201610814179.3
• 申請日: 2016-09-09
• 公開（公告）號: CN106613938A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 胡頌平;張琳;鄭敏;毛偉偉;杜鵑;余建
• 申請（專利權）人: 江西農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明屬于農業技術領域，具體地說，涉及一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法。

背景技術

蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb)Trev.)為蕨類植物，屬石杉(Huperiaceae)，石杉屬(Huperzia Bernh)，又名救命王、千層塔、金不換。民間用于治療癰癤腫毒，跌打損傷等。分布于全國各地，也廣布于亞洲其他地區、大洋洲以及中美洲的古巴、墨西哥等地^[1]。多生于山地密林下或溝谷陰濕土中,海拔400m～1600m.群落上層喬木樹種主要有毛竹(Phyllostachys heterocyc la)、三尖杉(Cephalotaxus fortunei),灌木樹種有木斷木(Loropetalum chinense)、金銀花(Lonicera japonica)、映山紅(Rhododendron mariesii)、紫金牛(Maesa japonica)、格藥柃(Eurya muricata),草本植物有蕨、多花黃精(Polygonatum cyrtonema)、三脈紫菀(Aster geratoides)、澤蘭(Eupatorium japonicum)及浙皖粗筒苣苔(Briggsia chienii),蛇足石杉伴生植物有金發蘚(Polytrichum commune)及暖地大葉蘚(Rhodobryum giganteum)等蘚類。植株為叢生的草本植物,高10cm～24cm,莖上部為紅色或綠色.不定根生于主莖基部,伸入土中或基質.主莖直立,或下部斜升,圓柱形,單一或一至數回二叉分枝,春季其頂端常生有芽胞,外被1個～3個綠褐色卵狀披針形芽鱗片,芽胞落地成新苗.葉螺旋狀著生,橢圓狀披針形,有明顯的短柄,葉長1cm～3cm,寬2mm～4mm,頂端銳尖,基部漸狹成楔形,邊緣有不規則的尖鋸齒；中脈明顯；葉薄紙質,兩面光滑.孢子葉與營養葉同形或異形,綠色；孢子囊腎形,單生于葉腋間,不集成穗,多生于植株的上部,淡黃色,光滑,成熟時橫裂；孢子一型,圓球狀四面體^[2]。

蛇足石杉是一種珍貴的藥用植物,自1972年國內首次報道該植物的生物堿在動物試驗上有橫紋肌松馳作用后,已從中分得13個生物堿單體.藥理實驗證明,石杉堿甲和乙具有很強的抑制膽堿酯酶的活性、提高學習記憶和改善老年人記憶功能的效果,并能用于治療重癥肌無力.鑒于其重要的藥用價值,對它的研究已被廣泛重視^[2]。

近年來，由于人們認識到：蛇足石杉含有的石杉堿甲具有高抗膽堿脂酶活性，對于改善記憶力，治療中老年癡呆及重癥肌無力具有良好的療效且毒副作用小，潛在的市場前景廣闊，因此，該植物越來越受到人們的重視。但由于蛇足石杉資源分散，而且許多相對集中的產地均位于自然保護區和風景區范圍內，同時，蛇足石杉是一種多年生、生長緩慢的小草本，年凈生物量的增長速率極為有限，長成一顆高12cm的成苗，在自然條件下大約需要6～7年的時間，資源更新周期較長，不可大規模開采，現有技術中急需一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法。

發明內容

本發明的目的在于克服上述技術存在的缺陷，提供一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法。

其具體技術方案為：

一種有效的蛇足石杉愈傷組織培養方法，包括以下步驟：

步驟1、蛇足石杉莖尖采用洗潔精清洗2次，無菌水清洗4次，采取0.15％升汞液滅菌5min，無菌水清洗4-6次；

步驟2、將步驟1中清洗好的蛇足石杉莖尖在解剖鏡下取0.1-0.2mm長的微莖尖；

步驟3、將微莖尖進行蛇足石杉愈傷組織培養，采用MS培養基，加入0.1μM IBA和1.5μM KT以及3mg/L谷氨酰胺，培養條件為25度恒溫，14h光周期培養。

進一步，步驟3中培養過程中加入抑制內生菌的方案為：青霉素50000IU/L，鏈霉素50mg/L，兩性霉素B 750μg/L，孔雀石綠1.5-1.8mg/L。

與現有技術相比，本發明的有益效果：

本發明提供了迄今為止蛇足石杉人工組織培養的有效方法與技術，出愈率可達25％以上，采用多次滅菌和添加內生菌抑制劑AAS的方法，解決了蛇足石杉愈傷組織培養過程中產生的內生真菌污染問題，有望實現蛇足石杉愈傷組織培養方法上的突破。

具體實施方式

下面結合具體實施方案對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。

1.1材料

實驗材料采自于江西省廬山，由胡頌平老師2014年12月引種于江西農大溫室內。

1.2培養基