[發明專利]實時熒光PCR鑒別藍莓成分的組合物、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201610809912.2
• 申請日: 2016-09-07
• 公開（公告）號: CN107805671B
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 吳亞君;陳穎;楊艷歌;劉鳴暢;韓建勛;王斌
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及藍莓成分的實時熒光PCR方法。本發明還涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探針組合物。本發明還涉及包含所述組合物的實時熒光PCR試劑盒。使用本發明的組合物進行實時熒光PCR檢測，能夠通過簡單、快速、特異且靈敏地檢測果干、果醬、果汁（清汁除外）等食品中藍莓源性成分。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及用于定性檢測藍莓成分Taqman實時熒光PCR方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探針組合物，以及包含所述組合物的試劑盒。

背景技術

藍莓狹義上是指一群在植物分類系統上越橘屬（Vaccinium）越橘亞屬青液果組（學名：Cyanococcus）的開花植物，廣義上包括越橘屬中長有藍色漿果的所有物種，是一種新興的小漿果類果樹。根據樹體特征、生態特性及果實特點，藍莓劃分為兔眼藍莓、南高叢藍莓、北高叢藍莓、半高叢藍莓、矮叢藍莓五個品種群。藍莓果實營養豐富，除蛋白質、脂肪、碳水化合物，VA、VE、超氧化物歧化酶(SOD)等，藍莓的微量元素含量也很高，鮮果中含鈣、磷、鎂、鋅、鐵、鍺、銅等。除含有常見的營養成分外，藍莓果實中還含有豐富的花青苷等營養成分，因此，常被譽為“漿果之王”、“水果皇后”，具有較高經濟價值和廣闊的開發前景。

隨著藍莓及其果干、果醬、果汁等產品風靡世界，其豐富的營養價值、高昂的價格促使藍莓摻假現象愈演愈烈，亟需開發簡便、快捷的真偽鑒別技術。以往對其進行的研究主要集中在液相色譜、質譜、色質聯用以及光譜等常規理化技術上，但理化方法特異性不強、檢測費用高，易受原料種類和產地的影響。隨著分子生物學技術的快速發展，基于DNA的各種分子生物學技術通過檢測物種特異性基因片段來判斷物種成分，具有特異性強，靈敏度高，不易受環境條件干擾，結果穩定等優點，在藍莓等小漿果的鑒定中的應用越來越廣泛。

發明內容

本發明的目的在于，簡單、快速、特異且靈敏地檢測食品及果汁（清汁除外）中的藍莓成分，能有效防止果汁、果醬等藍莓產品中添加其他廉價水果的造假方式。

本發明的發明人根據果蔬內參基因NADH，設計了能夠通用于果蔬內參照的實時熒光PCR檢測方法；以藍莓葉綠體matk 基因為目標，設計了能特異性檢測藍莓成分的引物和探針，靶序列244 bp，保證能從果醬、果汁等沉淀中檢測目標植物成分。

在本發明的一個方面，提供了通用于果蔬成分內參照的寡核苷酸引物上游NADH-F: 5’-GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA-3’（SEQ ID No.1），和下游NADH-R: 5’-AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA-3’（SEQ ID No.2）。探針為NADH-P: 5’-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-3’（SEQ ID No.3），在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。該引物可特異性識別果蔬成分的NADH序列，擴增片段長度138 bp。特異性擴增反應條件為：50℃ 2 min；95℃預變性 10 min；95℃ 15s，60℃ 1 min，40個循環。

在本發明的一個方面，還提供了特異性檢測藍莓成分的特異性寡核苷酸引物上游Buleberry-F：5’-AGCAACATGACGTCATATATCCACT-3’（SEQ ID No.4），和下游Buleberry-R：5’- GAATACAAATTTGTATTGTACCCCA -3’（SEQ ID No.5）。探針為Buleberry-P：5’-TGCACTTGCTCATGATCGTGGTTTAAATAGATT-3’（SEQ ID No.6），在探針的3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA，5’端連接有一個熒光報告基團FAM。該引物可特異性識別藍莓的matk序列，擴增片段長度244 bp。特異性擴增反應條件為：50℃ 2 min；95℃預變性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1min，40個循環。

在本發明的另一個方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的組合物，所述組合物包含選自以下（1）至（2）中的任意一組或多組引物和探針序列：