[發明專利]視網膜色素上皮細胞的凍存液及其應用

有效

• 申請號: 201610809307.5
• 申請日: 2016-09-07
• 公開（公告）號: CN107787960B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 袁松濤;范國平;沈涵;方王怡;劉慶淮
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學第一附屬醫院;江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;A61L27/38
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;徐嘉慧

本發明提供了視網膜色素上皮細胞的凍存液及其應用。具體地，本發明提供了一種無血清的凍存液，所述凍存液含有二甲基亞砜(DMSO)、血小板裂解液(HPL)，和任選的無血清培養基。本發明還提供了本發明凍存液凍存和復蘇的人視網膜色素上皮細胞。實驗表明，復蘇后視網膜色素上皮細胞的活性高達90％以上，接種培養后形態上具有呈典型的六邊形鋪路石樣，蛋白標記物RPE65呈陽性的細胞(即RPE65⁺視網膜色素上皮細胞)的比例高達98％。

技術領域

本發明涉及細胞培養領域。更具體地，本發明涉及視網膜色素上皮細胞的凍存液及其應用。

背景技術

視網膜退行性病變是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年齡相關性黃斑變性、視網膜色素變性、Stargardt病。其中年齡相關性黃斑變性患者，全球大約有3千萬到5千萬，而視網膜色素變性患者約1百萬。目前我國的年齡相關性黃斑變性患者大約超過2000萬人，并預計將在2050年增加一倍。

由于視網膜退行性病變主要表現為黃斑區視網膜色素上皮(Retinal PigmentEpithelium,RPE)的損傷，因此再生醫學RPE細胞的替代移植治療成為治療研究的主要方向。迄今已報道了多種來源的RPE細胞移植，主要有患者自體RPE細胞移植、虹膜色素上皮細胞(Iris Pigment Epithelium,IPE)移植，胚胎和成人RPE細胞移植，以及胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells,ESCs)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)來源的RPE細胞移植。這些細胞移植在動物實驗中均顯示出明確的治療作用，但是又均存在各自的缺陷。IPE對某些視網膜變性模型具有治療作用，但是對IPE和RPE的表達譜研究表明IPE缺乏視紫紅質循環中的某些關鍵酶，并不能完全替代RPE的生理功能。

胚胎干細胞的臨床應用存在倫理爭議，因潛在致瘤性其安全性也始終令人詬病；iPSCs在構建過程中被導入了潛在的原癌基因，逆轉錄病毒整合進入宿主基因組也會增加致瘤的風險，最近的研究也證實了iPSCs比胚胎干細胞有更高的畸胎瘤形成傾向。雖然有研究報道減少或完全去除外源性轉錄因子，或者通過小分子化合物，或者通過導入后再去除的辦法來解決問題。但是無論那一種方法對iPSCs進入臨床前的安全性還有待進一步驗證。

研究表明，人RPE細胞具有免疫原性小，不引起T細胞顯著的特異性免疫反應，還可以抑制T細胞激活，避免了免疫抑制劑的使用；具有極大的體外增殖能力，一個人眼球可以用于治療數百名AMD患者，減輕了對人RPE細胞臨床應用的取材限制、經濟負擔和倫理爭論；人RPE細胞在體內可以分泌營養因子，與宿主視網膜形成突觸連接；在致腫瘤性風險上明顯優于干細胞來源的RPE細胞；能夠表達多種RPE特有的功能性標志物等優點，是視網膜色素上皮細胞移植替代治療最有希望的細胞來源之一。

人視網膜色素上皮細胞的增殖能力巨大，臨床應用前景巨大，因此對細胞制劑有長期保存和便于臨床注射使用的要求。以往視網膜色素上皮細胞的凍存都是在添加動物血清(主要為FBS)的培養體系下進行的。一方面，由于動物血清具有異種蛋白免疫排斥的風險，且動物血清中的成分不明確，可能含有動物來源的病原體，易被病毒、支原體、瘋牛病病毒感染，在生產臨床級別的人用細胞制劑時，理論上會導致一些病原體的傳播，因此在臨床應用中具有潛在的危險。另一方面，血清間具有批次差異，造成不同批次凍存的細胞表型、增殖能力、長期培養后的細胞功能等存在較大差異，直接影響了視網膜色素上皮細胞的臨床應用。因此，如果想讓人視網膜色素上皮細胞進行大規模生產并廣泛應用于臨床，必須有無動物源性成分的體外培養方法。而目前市場上的臨床級別凍存液(不含動物源性成分)成分復雜，成本昂貴，而且復蘇效率較低，并不適合臨床上大規模生產。

綜上所述，本領域迫切需要開發一種適用于視網膜色素上皮細胞的無動物血清(如胎牛血清)且復蘇效率高的凍存液。

發明內容

本發明的目的就是提供一種適用于視網膜色素上皮細胞的無動物血清、復蘇效率高的凍存液及其制法和用途。