[發明專利]一種制備可實時示蹤iPSCs源性神經元的方法

有效

• 申請號: 201610805713.4
• 申請日: 2016-09-07
• 公開（公告）號: CN106834233B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 張京鐘;余爽
• 申請（專利權）人: 余爽
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/65;C12N5/0793
• 代理公司: 蘇州知途知識產權代理事務所(普通合伙) 32299
• 代理人: 馬剛強

1.一種制備可實時示蹤iPSCs源性神經元的方法，其特征在于，采用Crispr/Cas9基因編輯技術將報告基因mRFP敲入到TUBB3等位基因中，使TUBB3編碼序列與mRFP編碼序列通過2A肽鏈連接，獲得TUBB3-2A-mRFP序列，并進而制得含有TUBB3-2A-mRFP序列的人iPSCs記為hiPSCs-TUBB3-mRFP；并通過定向誘導分化程序，將制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP高效分化為神經元，即得。

2.根據權利要求1所述的制備可實時示蹤iPSCs源性神經元的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）構建靶向載體pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA以hiPSCs的基因組DNA為模板，設計PrimerTUBB3-1-short和Primer TUBB3-2為引物，通過PCR反應得到DNA片段TUBB3-5HA；

Primer TUBB3-1-short：ggatgtggtgcggaaggagtg；

Primer TUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；

以TUBB3-5HA為模板，設計Primer TUBB3-1-longnew和Primer TUBB3-2為引物，通過PCR反應得到與載體序列有重疊的DNA片段的TUBB3-5HA-long；

Primer TUBB3-1-longnew：cgggctgcagcgaccaatgtggggatgtggtgcggaaggagtg；PrimerTUBB3-2：cttggggccctgggcctccga；

以hiPSCs的基因組DNA為模板，設計Primer TUBB3-5和Primer TUBB3-6-short為引物，通過PCR反應得到DNA片段TUBB3-3HA；

Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；

Primer TUBB3-6-short：actgtggagggctgggcagtc；

以得到的TUBB3-3HA為模板，設計Primer TUBB3-6-longnew和Primer TUBB3-5為引物，通過PCR反應得到與載體序列有重疊的DNA片段TUBB3-3HA-long；

Primer TUBB3-6-longnew：gataagcttgatatccactgtggactgtggagggctgggcagtc；

Primer TUBB3-5：agctgctcgcagctggagtg；

以mRFP序列為模板，設計Primer TUBB3-3和Primer TUBB3-4為引物，通過PCR反應得到與TUBB3-5HA-long有重疊的DNA片段TagRFP；

Primer TUBB3-3：cggaggcccagggccccaagagggcaaagagggccacgaacttctctctgttaaagc；

Primer TUBB3-4：cactccagctgcgagcagctctatcaattaagtttgtgccccag；

取純化的pSC線性化載體、TUBB3-5HA-long、TagRFP和TUBB3-3HA-long片段混勻，通過Gibson克隆試劑盒制備得到pSC-TUBB3-5HA-mRFP-3HA靶向載體，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

（2）構建sgRNA導向載體設計如下結構的序列1和序列2混勻，在100℃下加熱，退火后與pBS-U6-sgRNA載體連接，制備得到pBS-U6-TUBB3-sgRNA導向載體，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；

序列1：CACCGGTACATCTCGCCCTCTTCCT；

序列2：AAACAGGAAG AGGGCGAGAT GTACC；

（3）構建攜帶EGFP報告基因的Cas9表達載體取如SEQ ID No.6所示核苷酸序列結構的IRES-EGFP序列亞克隆到pCAG-Cas9-bpA載體中的Cas9片段的下游，構建得到pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA表達載體，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

（4）制備hiPSCs單細胞懸液

取Target vector、導向載體pBS-U6-TUBB3-sgRNA和pCAG-Cas9-IRES-EGFP-bpA混勻，在lipofectamine 3000的介導下共轉染至hiPSCs，制備得到hiPSCs單細胞懸液；

（5）擴增含有TUBB3-mRFP的陽性hiPSCs克隆分選制得的hiPSCs單細胞懸液，將EGFP的陽性hiPSCs細胞以極低密度接種在含有E8條件培養基孔板，并挑取單細胞克隆進一步培養通過PCR鑒定并獲得含有TUBB3-mRFP的陽性hiPSCs克隆，記為hiPSCs-TUBB3-mRFP；

（6）制備攜帶Mash1、Neurogenin2的慢病毒表達載體以中國人總RNA為模板，通過RT-PCR方法克隆人Mash1 cDNA和Ngn2cDNA，然后在亞克隆至含有報告基因EGFP的強力霉素誘導型慢病毒表達載體上，分別制得具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列的載體Tet-O-hMash1-IRES-EGFP和具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的載體Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP；

（7）制備慢病毒上清液分別把Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP表達載體與慢病毒包裝系統混勻，在lipofectamine2000的介導下轉染至293FT細胞系，分別制得病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP；

（8）hiPSCs-TUBB3-mRFP慢病毒感染把制得的hiPSCs-TUBB3-mRFP進行培養，并取病毒上清Tet-O-hMash1-IRES-EGFP、Tet-O-hNgn2-IRES-EGFP、轉錄激活子rtTA2感染hiPSCs-TUBB3-mRFP，感染后更換為分化培養基進行定向分化培養，即得。